一种抗BRCA1单克隆抗体及其用途制造技术

本发明专利技术属于诊断技术领域，具体涉及一种抗BRCA1单克隆抗体及其用途。本发明专利技术以纯化后的BRCA1蛋白片段作为免疫原，免疫小鼠后提取免疫成功的小鼠脾脏淋巴细胞，通过细胞融合技术将淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，经过二轮亚克隆筛选后获得稳定分泌抗BRCA1的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，从而获得抗BRCA1单克隆抗体，本发明专利技术的抗BRCA1单克隆抗体可用于检测BRCA1蛋白的生物学检测试剂，并应用在制备卵巢癌相关检测产品中。

A monoclonal antibody against BRCA1 and its application

【技术实现步骤摘要】
一种抗BRCA1单克隆抗体及其用途
本专利技术属于生物诊断
，具体涉及一种抗BRCA1单克隆抗体及其用途。
技术介绍
卵巢癌是妇科肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一，也是最为致命的女性生殖系统癌症，死亡率位于妇科肿瘤首位。大量病例对照研究及临床报告资料显示，卵巢癌的发生与遗传因素有着密切联系，卵巢癌家族史是卵巢癌发病最重要的危险因素。遗传性乳腺癌和卵巢癌的易感基因BRCA1（breastandovariancancersusceptibilitygene）的突变在遗传性卵巢癌的发生、发展中具有重要作用，且其突变率与家族中具有卵巢癌病史的人数呈正相关。研究表明，BRCA1突变与多数遗传性卵巢癌相关，且主要在遗传性及早发性卵巢癌中起作用。BRCA1在遗传性卵巢癌患者中的突变率最高约为50％~100％，在卵巢患者的1~3级亲属中突变携带率约10％~30％，而在普通人群中仅不到0.1％，BRCA1基因的突变以常染色体显性遗传的方式遗传给子代。BRCA1作为一种肿瘤抑制基因，在正常卵巢上皮细胞中起重要的转录调控作用，参与细胞周期的调节，抑制细胞增殖，促进细胞终末分化，诱导细胞凋亡和参与细胞DNA损伤修复，对维持基因组的稳定发挥重要作用，而BRCA1基因的突变或缺失则导致基因组的不稳定性，继而发生恶变，成为诱发卵巢癌的主要原因之一。因此，建立一种可行的、快速的、准确的卵巢癌早期检测方法，对指导临床上评估卵巢癌遗传风险，卵巢癌的治疗，改善卵巢癌预后的意义十分关键。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的不足，提供一种抗BRCA1单克隆抗体及其用途。本专利技术利用BRCA1蛋白片段作为免疫原免疫BALB/c小鼠，利用细胞融合技术将免疫成功的小鼠脾脏淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞相融合筛选能够稳定分泌抗BRCA1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，大量生产BRCA1单克隆抗体，经纯化后获得高纯度的抗BRCA1单克隆抗体，获得的抗BRCA1单克隆抗体效价高、特异性好，可直接应用于分子免疫学研究，或制成多种体外诊断试剂盒用于检测BRCA1抗原的免疫检测工具中。可用于制备抗BRCA1的生物诊断试剂的研究与开发。本专利技术的方案通过如下技术手段得以实现：本专利技术所述抗BRCA1单克隆抗体，其重链可变区氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，其轻链可变区序列氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。在某一具体实施方式中，本专利技术还具体公开了所述BRCA1单克隆抗体的制备方法，首先用BRCA1蛋白片段免疫BALB/c小鼠，再用免疫成功小鼠的脾脏淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，通过筛选阳性克隆得到特异性分泌抗BRCA1单克隆抗体杂交瘤细胞株，将该细胞接种于提前用液体石蜡致敏的BALB/c小鼠腹腔，大量生产抗BRCA1单克隆抗体，并通过蛋白纯化的方式制备得到高纯度的抗BRCA1单克隆抗体。所述蛋白免疫为经过三次蛋白免疫；所述骨髓瘤细胞为SP2/0骨髓瘤细胞。本专利技术还提供了一种能产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本专利技术还提供所述的抗BRCA1单克隆抗体在制备免疫学检测工具中的应用。所述的抗BRCA1单克隆抗体在制备抗BRCA1的生物学检测试剂中的用途。进一步的所述的用途为制备用于检测BRCA1蛋白抗原的试剂中的用途。本专利技术提供的单克隆抗体在制备卵巢癌相关检测产品中的应用。采用本专利技术所提供的抗BRCA1单克隆抗体能特异地识别卵巢组织中的BRCA1蛋白，实现对卵巢组织中BRCA1蛋白的准确定位。BRCA1蛋白在正常人卵巢组织中均正常表达，表达于细胞核中，无细胞浆的错位表达；而在卵巢癌组织中则出现明显的错位表达，定位于细胞浆。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术提供的抗BRCA1单克隆抗体能够特异性的结合BRCA1蛋白，减少了可能的交叉反应，特异性高。包含本专利技术所述抗BRCA1单克隆抗体的检测工具可以用于组织样本的免疫组化检测，有效提高非治疗目的的肿瘤标本免疫组化检测的精确度，尤其有助于提高低分化或未分化肿瘤的检测手段的准确率。附图说明图1是重组蛋白BRCA1组分收集的SDS-PAGE电泳图；图2是纯化后的BRCA1单克隆抗体组分收集的SDS-PAGE电泳图；图3是不同稀释度BRCA1单克隆抗体的免疫效价检测结果；图4是BRCA1单克隆抗体的特异性及交叉反应鉴定结果；图5是对临床患者卵巢组织进行了BRCA1蛋白的免疫组化检测结果示意图。具体实施方式本专利技术公开了一种抗BRCA1单克隆抗体及其用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。以下实施案例中的方法、设备、材料，如果未进行特别说明，均为本领域常规方法、设备和材料，均可由市场购得。实施例1：BRCA1单克隆抗体制备（1）重组BRCA1蛋白片段的表达与纯化重组质粒pET-30a-BRCA1（购自Addgene公司），采用42℃热激90s的方法将重组质粒转化进大肠杆菌BL21，挑取卡那霉素抗性的菌斑，在500mLLB培养基中培养至当菌液的OD为0.6~0.8时，加入0.5mMIPTG诱导目标蛋白的表达，25℃恒温培养12h后，收集菌体，超声破菌，离心收集上清。将菌体裂解液上清加入镍柱（购自ThermoFisher）进行纯化蛋白，500mM咪唑缓冲液洗脱重组蛋白，SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达，图1是重组蛋白BRCA1组分收集的SDS-PAGE电泳图；如图1所示，BRCA1蛋白经一次洗脱即能获得较高的纯度，收集洗脱后的蛋白，冻干后进行后续动物免疫。（2）BALB/c小鼠的免疫与效价检测本实施例所用BALB/c小鼠购自南京大学动物模式研究所。按常规方法进行小鼠免疫（参考北京大学出版社出版的《现代抗体技术及其应用》和科学出版社的《抗体制备与使用实验指南》）。用间接ELISA法检测免疫后小鼠血清效价。取重组BRCA1蛋白，用pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液将BRCA1蛋白稀释为1μg/mL后加入96孔酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜，取出包被过夜的酶标板，TBS-T缓冲液洗涤3次后，拍干酶标板，4℃贮存待用。第二次免疫后1周，从小鼠尾静脉适量采血，5000g离心15min分离血清，用样本稀释液（含有0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液）将血清按1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000梯度进行稀释，每孔100μL加入待检测酶标板，37℃，孵育1h后，经TBS-T缓冲液洗涤3次，拍干酶标板，每孔加入100μL1:5000稀释后的HRP标记的山羊抗小鼠二抗（购自JacksonImmunoResearch公司），37℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗BRCA1单克隆抗体其特征在于，所述抗体包括重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗BRCA1单克隆抗体其特征在于，所述抗体包括重链可变区，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。


2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体还包括轻链可变区，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。


3.一种能产生权利要求1所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。


4.根据权利要求1所述的抗BRCA1单克隆抗体在制...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晗青，屠志刚，
申请(专利权)人：江苏莱森生物科技研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32