一种抗CK18单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗CK18单克隆抗体包含重链可变区的VHCDR1‑3和轻链可变区的VLCDR1‑3序列及其制备方法和在非酒精性脂肪肝病(NAFLD)检测中的应用，当cutoff值设250U/L时，用于诊断NAFLD的灵敏度72％，阴性预测值90％以上。还可应用于NAFLD评估模型。本发明专利技术成功获得鼠单克隆杂交瘤细胞株的基础上，测序并获得有效的抗体，应用该重组抗体制备定性或定量检测试剂盒具有性能稳定，定量准确等优点，能够实现对样本中CK18高灵敏度、高特异性快速检测。

A monoclonal antibody against CK18 and its application

【技术实现步骤摘要】
一种抗CK18单克隆抗体及其应用
本专利技术涉及免疫学领域，尤其涉及一种抗CK18单克隆抗体及其应用。
技术介绍
随着乙肝疫苗的普及，乙肝新发病人少见，而糖尿病、脂肪肝等富贵病发病率逐年上升。统计表明，我国非酒精性脂肪肝病(NAFLD)已占了肝病总数的50％。NAFLD与乙肝最大的病理区别在于前者肝细胞以凋亡为主，而后者是坏死。肝细胞坏死主要表现为血中肝酶上升，而肝细胞凋亡为主的肝病肝酶往往没有明显升高。因此临床上用肝酶诊断或评估肝细胞凋亡为主的肝病往往效果不佳，亟待一种灵敏度高的肝细胞凋亡特异性指标能弥补这一缺陷。细胞角蛋白18(CK18)是细胞骨架蛋白的一种，除了起到细胞骨架的支撑作用以外，还通过多种途径参与着细胞内的各种反应。CK18作为肝细胞凋亡的指标，在包括非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的很多肝脏疾病中都有升高，并且与NAFLD患者肝细胞的脂肪变性、小叶炎症、气球样变的程度及纤维化程度相关，同时有中重度纤维化患者的血清CK18水平明显高于轻度或无纤维化患者的水平。当细胞受到损伤性刺激发生凋亡时，多条途径被激活，同时激活了Caspase系统，Caspase在两个位点进行切割，这种形式的裂解是高度凋亡特异的，并且凋亡片段对蛋白酶体的降解作用稳定，能够释放进入血浆中。M30抗原位于CK18裂解片段中，且只在裂解片段能够暴露，因此，M30抗体对于上皮细胞的凋亡是具有特异性的。细胞角蛋白18片段M65(CK18-M65)作为一个无创性的检测手段，在NAFLD的诊断、NAFL和HASH的鉴别及纤维化程度的判断上有重要临床价值。因此，研制出一种抗CK18的单克隆抗体具有重要的意义。
技术实现思路
为了解决现有技术的问题，一方面，本专利技术提供了一种抗CK18单克隆抗体，所述抗CK18单克隆抗体包含重链可变区的VHCDR1-3和轻链可变区的VLCDR1-3；VHCDR1：GGATACACATTCACTGAATACAGCVHCDR2：ATAAATCCTAACAATGGTGGAACTVHCDR3：GCAAACTAGGTTACGACGGTTTGCCTACVLCDR1：CAGAGCCTTGTTCACAGTAATGGAAACACCTATVLCDR2：AAAGTTTACVLCDR3：TCTCAAAGTACACATGTTCCGTGGACG。作为本专利技术实施方式的进一步改进，所述VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3的氨基酸序列分别如SEQIDNOs：1-3所示：SEQIDNO：1GYTFTEYSSEQIDNO：2INPNNGGTSEQIDNO：3ANYGYDGFAY。作为本专利技术实施方式的进一步改进，所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的氨基酸序列分别如SEQIDNOs：4-6所示：SEQIDNO：4QSLFHRNGNTYSEQIDNO：5KVYSEQIDNO：6SQSTHVPWT。另一方面，本专利技术还提供了一种上述的抗CK18单克隆抗体在CK18-M30包被抗体的应用。作为本专利技术实施方式的进一步改进，所述CK18-M30单克隆抗体包含重链可变区的VHCDR1-3和轻链可变区的VLCDR1-3；VHCDR1：GGATACACATTCACTGAATACACCVHCDR2：ATTAATCCTAAAAATGGCACTVHCDR3：GCAACATATGGGTTTCGAAATTACTTTGACTACVLCDR1：CAGAGCCTTTTCCACAGAAATGGAAACACCTATVLCDR2：AAAGTCTCCVLCDR3：TCTCAAAGTACACATGTGCCGTGGACG。作为本专利技术实施方式的进一步改进，所述VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3的氨基酸序列分别如SEQIDNOs：7-9所示：SEQIDNO：7YTFTEYTSEQIDNO：8INPKNGTSEQIDNO：9ATYGFRNYFDY。作为本专利技术实施方式的进一步改进，所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的氨基酸序列分别如SEQIDNOs：10-12所示：SEQIDNO：10QSLVHSNGNTYSEQIDNO：11KVSSEQIDNO：12SQSTHVPWT。再一方面，本专利技术公开了一种上述的抗CK18单克隆抗体在制备CK18免疫检测工具中的应用；所述免疫检测工具包括CK18-M65试剂盒。本专利技术进一步公开了抗CK18单克隆抗体在制备检测CK18相关性肝病诊断试剂中的应用。又一方面，本专利技术公开了上述的抗CK18单克隆抗体的制备方法，所述CK18的单克隆抗体由杂交瘤细胞株分泌产生；所述杂交瘤细胞株制备方法包含以下步骤：1)合成含有CK18蛋白N端第237至第246位的一段10个氨基酸的肽段的CK19抗原表位肽作为免疫抗原；2)用1)制备的多肽免疫小鼠；3)骨髓瘤细胞悬液和免疫小鼠的脾脏B淋巴细胞进行细胞融合；4)培养融合后的细胞，测杂交瘤效价，筛选阳性细胞株，获得所述杂交瘤细胞株；所述杂交瘤细胞株，于2016年3月6日宝藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO：C201646。本专利技术具有如下有益效果：本专利技术克服了现有技术中的免疫原性低、无法获得鼠单抗的问题，通过增加免疫次数等方法，成功制备了鼠单克隆杂交瘤细胞株，测序获得CDR区序列，重组获得含人Fc的IgG和IgA重组蛋白，用于制备定量测定试剂盒；本专利技术所述针对CK18-M65蛋白片段的特异性单克隆抗体，提高了实验的特异性和可靠性，并建立了基于抗CK18单克隆抗体的免疫检测技术，主要用于早期肝纤维化、肝脂肪性炎症、药物性肝损伤和自体免疫性肝病。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术实施例提供的一种CK18-M65ELISA试剂盒的校准曲线；图2是本专利技术实施例提供的一种CK18-M65荧光免疫层析试剂盒的校准曲线。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1一方面，本专利技术提供了一种抗CK18单克隆抗体，所述抗CK18单克隆抗体包含重链可变区的VHCDR1-3和轻链可变区的VLCDR1-3；VH本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗CK18单克隆抗体，其特征在于，所述抗CK18单克隆抗体包含重链可变区的VHCDR1-3和轻链可变区的VLCDR1-3；/nVHCDR1：GGATACACATTCACTGAATACAGC/nVHCDR2：ATAAATCCTAACAATGGTGGAACT/nVHCDR3：GCAAACTAGGTTACGACGGTTTGCCTAC/nVLCDR1：CAGAGCCTTGTTCACAGTAATGGAAACACCTAT/nVLCDR2：AAAGTTTAC/nVLCDR3：TCTCAAAGTACACATGTTCCGTGGACG。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗CK18单克隆抗体，其特征在于，所述抗CK18单克隆抗体包含重链可变区的VHCDR1-3和轻链可变区的VLCDR1-3；
VHCDR1：GGATACACATTCACTGAATACAGC
VHCDR2：ATAAATCCTAACAATGGTGGAACT
VHCDR3：GCAAACTAGGTTACGACGGTTTGCCTAC
VLCDR1：CAGAGCCTTGTTCACAGTAATGGAAACACCTAT
VLCDR2：AAAGTTTAC
VLCDR3：TCTCAAAGTACACATGTTCCGTGGACG。


2.根据权利要求1所述的抗CK18单克隆抗体，其特征在于，所述VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3的氨基酸序列分别如SEQIDNOs：1-3所示：
SEQIDNO：1GYTFTEYS
SEQIDNO：2INPNNGGT
SEQIDNO：3ANYGYDGFAY。


3.根据权利要求1所述的抗CK18单克隆抗体，其特征在于，所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的氨基酸序列分别如SEQIDNOs：4-6所示：
SEQIDNO：4QSLFHRNGNTY
SEQIDNO：5KVY
SEQIDNO：6SQST...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈菲，王莹，
申请(专利权)人：苏州和锐生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32