一种铜绿假单胞菌生物膜及其制备方法、应用技术

本发明专利技术属于高分子技术领域，公开了一种铜绿假单胞菌生物膜及其制备方法、应用，将细菌接种于琼脂平板上，挑取单个菌落接种于5mLLB培养液中振摇后将菌液离心，弃上清，细菌沉淀用无菌生理盐水洗涤，将细菌悬浮液用生理盐水调整菌液备用；在50ml锥形瓶里加入10ml上述备好的实验菌株菌液，加入10个载体，在37℃，110rpm恒温震荡培养20h使细菌粘附。体外培养铜绿假单胞菌生物膜结构，在调好浓度的细菌悬液内放入载体培养出生物膜结构，然后检测调整细菌浓度。这样的细菌生物膜结构稳定，重复性好。将准备好的载体移植入小鼠腹腔造成铜绿假单胞菌生物膜感染，然后研究其致病机制和温和灸干预治疗的效果。

A Pseudomonas aeruginosa biofilm and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种铜绿假单胞菌生物膜及其制备方法、应用
本专利技术属于高分子
，尤其涉及一种铜绿假单胞菌生物膜及其制备方法、应用。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：细菌生物膜(biofilm，BF)相关感染是一种广泛存在、涉及多学科的疾病。BF是指细菌吸附于固体物质表面后(如医用有机材料或机体黏膜表面)，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等多糖-蛋白复合物，使细菌相互粘连并将其自身菌体包裹于生物被膜之中，从而形成致密的膜样状态,是细菌的三维聚集体。随着生物医学材料的广泛使用，与细菌生物被膜有关的临床感染也日益增多，据统计65％的人类细菌感染与生物被膜有关，其中铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,P.a)是极为常见的细菌BF相关感染病原菌之一。许多慢性的难以治疗的感染，如慢性泛细支气管炎、囊性纤维化、慢性尿道感染等均与BF形成密切相关。由于P.a对多种抗生素(如某些β-内酞胺类、喹诺酮类、四环素类及氯霉素等)耐药，因此给临床治疗造成许多困难。P.a耐药的原因之一就是BF的形成。因此P.a生物被膜耐药性的研究己成为医学、微生物学、药学等众多领域关注的热点课题。于BF相关感染的防治措施，国内外研究主要集中在大环内酯类抗生素(红霉素、罗红霉素、阿奇霉素、克拉霉素等)、妥布霉素、米诺霉素、头孢他啶、喹诺酮类抗菌素左氧氟沙星、环丙沙星等对BF的抑制作用。但是长期低剂量应用抗菌素有增加细菌对抗菌素耐药的潜在危险。铜绿假单胞菌生物膜体外的模型制备技术已经基本成熟，体外制备的细菌生物膜载体移植到腹腔的手术比较成功，但是相关抗生素、中药等的干预疗效一直不理想。中医临床和实验研究都发现温和灸能明确增强机体的抵抗力，增强免疫功能，尤其是细胞免疫功能，而这恰好是前期研究发现能治愈这类感染的方向。现在研究人员都在专注铜绿假单胞菌生物膜感染的西药抗生素和中药的治疗，有一定疗效，但是很难治愈，而且经济负担大，还易引起菌群失调。而中华几千年传承的中医艾灸治疗，安全有效，经济实惠，治疗过程病人主观感受轻松舒适，在不知不觉中疾病就会慢慢好转，治愈。已经有研究明确艾灸对哮喘，炎症性肠病，类风湿性关节炎等的疗效。但是，还没有对铜绿假单胞菌生物膜感染的研究。综上所述，现有技术存在的问题是：铜绿假单胞菌生物膜感染的西药抗生素耐药现象一中，和中药的治疗有一定疗效，但是很难彻底治愈，而且经济负担大，还可能引起菌群失调，肝肾损害等。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种铜绿假单胞菌生物膜及其制备方法、应用。本专利技术是这样实现的，一种铜绿假单胞菌生物膜的制备方法，所述铜绿假单胞菌生物膜的制备方法包括以下步骤：步骤一，将细菌接种于琼脂平板上，挑取单个菌落接种于5mLLB培养液中37℃，200rmin-1振摇20h后将菌液3000rmin-1离心10min，弃上清，细菌沉淀用无菌生理盐水洗涤2次，将细菌悬浮液用生理盐水调整OD600＝0.05菌液备用；步骤二，在50ml锥形瓶里加入10ml上述备好的实验菌株菌液，加入10个载体，在37℃，110rpm恒温震荡培养20h使细菌粘附。本专利技术的另一目的在于提供一种所述铜绿假单胞菌生物膜的制备方法制备的铜绿假单胞菌生物膜。本专利技术的另一目的在于提供一种由所述铜绿假单胞菌生物膜制备的慢性难治性疾病药物。综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：体外培养铜绿假单胞菌生物膜结构，在调好浓度的细菌悬液内放入载体培养出生物膜结构，然后检测调整细菌浓度。这样的细菌生物膜结构稳定，重复性好。将准备好的载体移植入小鼠腹腔造成铜绿假单胞菌生物膜感染，然后研究其致病机制和温和灸干预治疗的效果。近几年来，人们越来越关注中医药的临床应用，批判一些伪科学。艾灸、针灸、拔罐、推拿等传统中医治疗的疗效已经充分被人们认可，并且走出国门，受到全世界人们的欢迎。传统的中医治疗，往往对一些西医疗效较差的慢性难治性疾病有非常独到的疗效，而且治疗费用往往非常低廉，治疗过程痛苦小见效快而易被病人接受。大量临床及实验研究发现艾灸具有明显提高机体的细胞免疫功能，而铜绿假单胞菌生物膜感染过程中往往机体细胞免疫功能低下，并且细胞免疫功能与预后明显相关。所以这种治疗方案的干预为这种疾病的治疗提供了新的更有临床意义的治疗方向。附图说明图1是本专利技术实施例提供的铜绿假单胞菌生物膜的制备方法流程图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。如图1所示，本专利技术实施例提供的铜绿假单胞菌生物膜的制备方法包括以下步骤：S101：将细菌接种于琼脂平板上，挑取单个菌落接种于5mLLB培养液中37℃，200rmin-1振摇20h后将菌液3000rmin-1离心10min，弃上清，细菌沉淀用无菌生理盐水洗涤2次，将细菌悬浮液用生理盐水调整OD600＝0.05菌液备用，此法所获得的细菌即为P.aeruginosa的浮游菌；S102：在50ml锥形瓶里加入10ml上述备好的实验菌株菌液，然后加入10个载体，在37℃，110rpm恒温震荡培养20h使细菌粘附。在步骤S102制备完成后可涂片，染色观察铜绿假单胞菌生物膜情况；小鼠在1％戊巴比妥钠0.1ml腹腔麻醉下，于左下腹部局部消毒后行约8mm切口逐层进入腹腔，将粘附有生物被膜的载体在无菌生理盐水中轻轻冲洗去除浮游菌后植入腹腔，丝线缝合切口。造模成功后，艾灸组用给与切口部位温和灸治疗；艾条垂直悬灸于皮肤之上10cm处，以大鼠无挣扎为度，上下调节艾条与皮肤的距离，灸治15min，每日一次。感染1d，3d，7d后可检测小鼠腹部感染情况，病理变化，与对照组对比观察干预治疗的效果。以上所述仅为本专利技术的较佳实施例而已，并不用以限制本专利技术，凡在本专利技术的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种铜绿假单胞菌生物膜的制备方法，其特征在于，所述铜绿假单胞菌生物膜的制备方法包括以下步骤：/n步骤一，将细菌接种于琼脂平板上，挑取单个菌落接种于5mLLB培养液中37℃，200rmin

【技术特征摘要】
1.一种铜绿假单胞菌生物膜的制备方法，其特征在于，所述铜绿假单胞菌生物膜的制备方法包括以下步骤：
步骤一，将细菌接种于琼脂平板上，挑取单个菌落接种于5mLLB培养液中37℃，200rmin-1振摇20h后将菌液3000rmin-1离心10min，弃上清，细菌沉淀用无菌生理盐水洗涤2次，将细菌悬浮液用生理盐水调整OD600＝0.05菌液备用；
步骤二，在50ml锥形瓶里加入10ml上述备好的实验菌株菌液，加入10个载体，在37℃，110rpm恒温震荡培养20h使细菌粘附。
...

【专利技术属性】
技术研发人员：景政，刘晓岚，荆雪宁，唐妮，刘晓庆，吕美珍，辛书超，
申请(专利权)人：山东中医药高等专科学校，
类型：发明
国别省市：山东;37