本发明专利技术涉及葡萄VyNRT1基因及其编码蛋白和基因在抗旱品种育种中的应用，属于植物基因工程技术领域。本发明专利技术中利用强启动子（花椰菜花叶病毒35S启动子）驱动原理的转基因技术，将燕山葡萄VyNRT1基因的超量表达载体转入拟南芥中，从而获得转基因拟南芥植株；实验证明，相对于转化空载体的拟南芥植株，超量表达VyNRT1基因导致转基因拟南芥中抗逆相关物质的积累和抗旱相关基因的表达，转基因植株抗旱性增强。因此，葡萄VyNRT1基因及其重组表达载体能够用于植物抗旱品种育种。
Application of vynrt1 gene, its coding protein and gene in drought resistant variety breeding
【技术实现步骤摘要】
葡萄VyNRT1基因及其编码蛋白和基因在抗旱品种育种中的应用
本专利技术涉及植物基因工程
，尤其涉及葡萄VyNRT1基因及其编码蛋白和基因在抗旱品种育种中的应用。
技术介绍
葡萄原产亚洲西部，世界各地均有栽培，世界各地的葡萄约95％集中分布在北半球，中国主要产区有安徽的萧县，新疆的吐鲁番、和田，山东的烟台，河北的张家口、宣化、昌黎，辽宁的大连、熊岳、沈阳及河南的芦庙乡、民权、仪封等地。在葡萄生长发育过程中水分对于葡萄的产量和品质有重要的影响，缺水容易使葡萄产业受到很大的威胁。在水资源匮乏的大背景之下，发掘抗旱葡萄资源、研究葡萄抗旱基因对提高葡萄抗旱性、培育抗旱新品种及节水栽培等都具有重要的科学价值和意义。氮素的吸收转运在植物适应干旱逆境中发挥着重要作用，而植物根系对NO3-的吸收及NO3-在植株体内的转运主要由NO3-转运蛋白(nitratetransporters，NRTs)介导。高等植物中已发现的NO3-转运蛋白主要包括NRT1和NRT2两类家族蛋白。在模式植物拟南芥中，已发现50多个NRT1家族成员，但其中仅有10个成员功能被研究清楚，可见葡萄中NRT1家族基因功能的研究还需进一步探究。有望发现与葡萄生长发育及抵御非生物胁迫相关的基因，将为葡萄抗逆性遗传改良提供新的思路。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种葡萄VyNRT1基因，其能够增加转基因植株中抗逆相关物质的积累和抗旱相关基因的表达，促进转基因植株抗旱性增强。该基因编码的葡萄VyNRT1蛋白能够促进转基因植株中积累抗逆相关物质导致转基因植株抗旱性增强。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种葡萄基因VyNRT1，所述葡萄基因VyNRT1的核苷酸序列如SEDIDNO.1所示。本专利技术还提供一种葡萄基因VyNRT1编码蛋白，所述编码蛋白的氨基酸序列如SEDIDNO.2所示，该编码蛋白的核苷酸序列位于SEDIDNO.1中的第16～1962位。本专利技术还提供了所述葡萄基因VyNRT1在植物抗旱品种育种中的应用。作为优选，上述葡萄基因VyNRT1应用于拟南芥或葡萄抗旱品种育种中。本专利技术中利用强启动子(花椰菜花叶病毒35S启动子)驱动原理的转基因技术，将燕山葡萄VyNRT1基因的超量表达载体转入拟南芥中，从而获得转基因拟南芥植株；实验证明，相对于转化空载体的拟南芥植株，超量表达VyNRT1基因导致转基因拟南芥中抗逆相关物质的积累和抗旱相关基因的表达，转基因植株抗旱性增强。因此，葡萄VyNRT1基因及其重组表达载体能够用于植物抗旱品种育种。附图说明图1为本专利技术中葡萄VyNRT1基因表达分析图；图2为本专利技术中转VyNRT1基因拟南芥植株的抗旱性鉴定图；图3为本专利技术中转VyNRT1基因拟南芥植株的生理特性分析图；图4为本专利技术中转基因拟南芥植株中抗旱相关基因的表达分析图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本专利技术保护范围的限定。实施例1葡萄VyNRT1基因表达分析燕山葡萄组培苗继代培养16d后，选择生长健壮表现一致的幼苗用于各种逆境处理。干旱处理：将葡萄幼苗从培养基中拔出，置于滤纸上暴露在室温为(32±1)℃、相对湿度为55％、光周期为光照14h/黑暗10h的条件下处理，在0、2、6、12、24h取样。低温处理：将组培苗置于温度为(4±1)℃、相对湿度为75％、光周期为光照14h/黑暗10h的条件下培养，在0、2、6、12、24h取样。盐胁迫：在三角瓶中加入20mL100mmol·L-1的NaCl溶液，在温度为(25±1)℃、相对湿度为75％、光周期为光照14h/黑暗10h的条件下培养，在0、2、6、12、24h取样。在三角瓶中加入等体积的蒸馏水作为盐胁迫处理的对照。正常培养的组培苗作为干旱和低温处理的对照。在大田生长8～10年的燕山葡萄，在转色期取葡萄果实，于盛花期取根系(第一新生侧根)、茎(新展开叶下第4～5片叶的茎段)、叶(新展开叶下第4～5片)、花序和卷须(新生枝条的第1个枝)等样品。用plus植物总RNA提取试剂盒(天根)提取葡萄叶片总RNA。普通反转录用PrimeScriptII1stStrandcDNASynthesisKit(TaKaRa)合成cDNA第一链。具体操作步骤如下：在PCR管中加入：Random6mers(50μM)1μL，dNTPMixture(10mMeach)1μL，TotalRNA2μg，RNasefreedH2O补齐至10μL，充分混匀，瞬时离心使溶液至PCR管底部。在PCR仪上65℃反应5min，冰上急冷。根据VyNRT1基因序列设计实时荧光定量PCR引物，正向引物序列为qRT-PCR-VyNRT1-F：5'-CCCTTATCCTTCTCATCCCAGT-3'(如SEQIDNO.3所示)；反向引物序列为qRT-PCR-VyNRT1-R：5'-GGAGCTTTATTACCATCTTCACCT-3'(如SEQIDNO.4所示)。以VyGAPDH基因为内参，正向引物序列为qRT-VyGAPDH-F：5'-CCCTTGTCCTCCCAACTCT-3'(如SEQIDNO.5所示)；反向引物序列为qRT-VyGAPDH-R：5'-CCTTCTCAGCACTGTCCCT-3'(如SEQIDNO.6所示)。实时荧光定量PCR按照TaKaRaPremixExTaqTMII(PerfectRealTime)说明在Bio-RadIQ5Real-TimePCRDetectionSystem(Bio-RadLaboratories,HercμLes，CA)上进行。25μL的反应体系：1μL的反转录模板；正反向引物各1μL；12.5μL的PremixExTaqTM(2×)；9μL的nuclease-freewater。反应程序为：95℃，30s；40cyclesof95℃for5s；57℃for30s；72℃for30s。结果采用2-ΔΔC(t)法进行分析。结果如图1所示，结果表明VyNRT1基因主要在根系中表达，其次在叶里表达量较高，在茎、花、果、卷须中的表达量较低；在低温处理后2h，VyNRT1转录本快速积累，在6h达到峰值，随后逐渐降低；在干旱和高盐处理后2h，VyNRT1转录本快速积累并达到峰值，随后均有所降低。试验例2转基因植株的获得将包含有VyNRT1基因编码区的ORF片段插入植物过量表达载体并将其转化入农杆菌中。将含有重组植物表达载体的农杆菌划线培养在LB平板(含60mg/L的Gent，100mg/L的Kan)上划线，置于28℃条件下培养24h；挑取单克隆在10mLLB液体培养基(附加相应的抗生素)中，在28℃条件下培养24h；取5mL菌液转移至50mL新鲜的LB液体培养基中本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种葡萄基因VyNRT1，其特征在于，所述葡萄基因VyNRT1的核苷酸序列如SED IDNO.1所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种葡萄基因VyNRT1，其特征在于，所述葡萄基因VyNRT1的核苷酸序列如SEDIDNO.1所示。
2.一种葡萄基因VyNRT1编码蛋白，其特征在于，所述编码蛋白的氨基酸序列如SE...
【专利技术属性】
技术研发人员：余义和，张贺程，杨芯贤，李敏，王磊磊，郭大龙，杨英军，张国海，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：河南;41
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