水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK18的基因工程应用制造技术

本发明专利技术公开了水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK18的基因工程应用。水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK18在创建提高水稻有效分蘖及产量、提高钾养分效率及加强光合产物由地上部(源)向根(库)的转运的新的水稻种质中的应用。本发明专利技术首次发现由水稻K

Genetic engineering application of rice potassium transporter gene oshak18

【技术实现步骤摘要】
水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK18的基因工程应用
本专利技术属于基因工程
，涉及水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK18的基因工程应用。
技术介绍
钾(K)作为植物生长必需的三大矿质营养元素之一，也是植物体内最丰富的一价阳离子，大约占植株干重的4-10％(LeighandWyn,1984)，在植物的整个生长发育过程中都起着极为重要的作用，例如，维持离子平衡、调节渗透压、调节酶的活性、参与蛋白质代谢、促进光合作用效率、参与养分运输和重新分配等(Armengaudetal.,2004；Anschützetal.,2014)。同时，K在植物体内的高度移动性，在根部吸收的K会由木质部运输到地上部，然后80％左右的K又会通过韧皮部重新输送到地下部，实现K在植物体内循环分配再利用(Deekenetal.,2002)。一般来说，植物细胞质内K的浓度保持在100mM左右；当植物K吸收不足时，很多生理生化过程都将受阻，植物的生长发育也会受到影响；在农作物中，低K直接影响到作物的产量(Brittoetal.,2008)。由于全球钾矿资源大量耗竭和分布不均匀(MengelandKirkby,1987)，作物缺K成为全球粮食生产的限制因子。如何通过生物技术手段增强作物在低K环境下K的吸收，维持作物体内的K的稳态平衡，提高K利用效率，这对于提高作物产量和品质意义重大，也是降低农业生产成本和维持农业可持续发展的重要途径。除了矿质养分之外，在影响作物产量的因素当中，它们的株型无疑是决定性要素。如六十年代的绿色革命，就是通过对小麦和水稻的矮化育种，提高它们的抗倒伏性，并配合化肥和农药的施用提高产量，因此在全世界拯救了数十亿的饥饿人口。水稻地上部的株型由株高、有效分蘖数、分蘖角度及穗粒数等构成，其中有效分蘖数对产量有至关重要的影响(Jiaoetal.,2010)。因此提高植株的有效分蘖数也是育种学家重点关注的要素。
技术实现思路
本专利技术的目是提供水稻K+转运蛋白基因OsHAK18的工程应用，主要是增加分蘖，提高产量及提高钾养分效率的功能。本专利技术的目的通过如下技术实现：水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK18，cDNA序列如SEQIDNO.1所示。一种重组表达载体，含有所述的水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK18。所述的重组表达载体，优先出发载体为pTCK303载体。所述的重组表达载体，进一步优选是所述的水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK18插到pTCK303载体KpnI和SpeI酶切位点后用HindⅢ和KpnI双酶切除Ubiquitin并插入OsHAK18基因自身启动子所得。所述的水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK18在增加作物的有效分蘖数和提高作物产量中的应用。所述的水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK18在加强光合产物由地上部(源)向根(库)的转运中的应用。所述的水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK18在创建提高水稻有效分蘖及产量、提高钾养分效率及加强光合产物由地上部(源)向根(库)的转运的新的水稻种质中的应用。所述的重组表达载体在增加作物的有效分蘖数和提高作物产量中的应用。所述的重组表达载体在加强光合产物由地上部(源)向根(库)的转运中的应用。所述的重组表达载体在创建提高水稻有效分蘖及产量、提高钾养分效率及加强光合产物由地上部(源)向根(库)的转运的新的水稻种质中的应用。本专利技术的有益效果：我们对ClusterIII的一个成员OsHAK18的研究发现由OsHAK18自身启动子引导的转基因日本晴水稻品种在田间和桶培表现为株高降低，有效分蘖和总分蘖数较野生型材料有大幅度增加，且水稻单株产量提高了25％左右，对这一基因的开发利用可为实现水稻高产和养分高效的协同作用提供了一个新途径。另外，我们还发现OsHAK18转运体参于水稻体内钾由地上部向根部的循环，这一循环决定了光合产物向根部的运输和分配，这一功能也是目前对HAK家族的基因功能的最新发现。因此，对此基因的应用有利于通过提高有效分蘖而提高水稻产量，并同时提高水稻的养分效率。1.本专利技术中，世界上首次发现由水稻K+转运蛋白基因OsHAK18构建的重组表达载体，通过农杆菌介导的水稻转基因技术转染到野生型水稻日本晴(Oryzasativa.ssp.cv.Japonica)中，我们发现OsHAK18转基因水稻材料的总分蘖、有效分蘖数和籽粒产量与野生型水稻相比显著提高。2.本专利技术中的OsHAK18基因来源于水稻，启动子也是OsHAK18基因上游的序列，不是外源基因，因此具有生物安全性，所构建的水稻K+转运蛋白基因OsHAK18植物表达载体可以直接用于农杆菌介导的植物遗传转化，获得OsHAK18基因增加植物有效分蘖的新种质。3.植物中有高达80％的K在植物体内通过循环而伴随其它物质(包括光合产物)的运输和分配，目前对K转运体参与这一运输的研究还很有限，而OsHAK18是HAK/KT/KUP家族成员中唯一被发现具有此功能的K转运体。4.在此基础上，我们提供了一种既能够通过提高水稻有效分蘖而提高产量，又能提高养分效率的新的水稻种质资源。附图说明图1OsHAK18转基因水稻材料的分子鉴定。图2OsHAK18转基因水稻的桶培和田间试验表型。图3OsHAK18转基因水稻成熟期K和可溶性总糖含量。图4pTCK303表达载体图谱。具体实施方式实施例1OsHAK18基因的克隆1.模板：提取正常水培2周大小的日本晴野生型水稻叶片的RNA并反转录成cDNA，作为克隆OsHAK18基因的PCR扩增的模板。2.PCR引物设计：在ARAMEMNON网站(http://aramemnon.botanik.uni-koeln.de/)找到OsHAK18的基因序列，利用引物设计软件Primer5.0设计引物，在引物的5’端和3’端加上KpnI(GGTACC)和SpeI(ACTAGT)酶切位点序列，再加上pTCK303质粒载体上的一段序列，构成一段46bp的同源重组引物(F1和R1)。上游引物F1：5'-TCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATGGAGACCAGAACAAATGA-3'(SEQIDNO.2)；下游引物R1：5'-TCATGGTCTTTGTAGTCCATACTAGTCACGTAGAAAACCTGCCCAA-3'(SEQIDNO.3)。3.OsHAK18基因PCR扩增：PCRBuffer2.5μl，dNTPMix2μl，上下游引物各1μl，模板1μl,KOD高保真酶0.5μl，双蒸水17μl。PCR扩增程序如下：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃复性延伸2min，35个循环后，72℃10min充分延伸，10℃保持。扩增的PCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测OsHAK18基因的大小为2382b，序列如SEQIDNO.1所示。实施例2植物表达载体p本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组表达载体，其特征在于含有水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK18,所述的水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK18的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组表达载体，其特征在于含有水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK18,所述的水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK18的cDNA序列如SEQIDNO.1所示。


2.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于所述的重组表达载体是将所述的水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK18插到pTCK303载体KpnⅠ和SpeⅠ酶切位点后用HindⅢ和KpnⅠ双酶切除Ubiquitin并插入OsHAK18基因自身启动子所得。


3.水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK18在增加作物的有效分蘖数和/或提高作物产量中的应用,所述的水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK18的cDNA序列如SEQIDNO.1所示。


4.水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK18在加强光合产物由地上部向根的转运中的应...

【专利技术属性】
技术研发人员：余玲，彭莉润，徐国华，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32