一种创建矮壮株型菊花的方法技术

本发明专利技术提供了一种通过转基因技术创制植株矮小、粗壮的菊花的方法，属于植物基因工程和转基因育种领域。该方法包括从菊花中克隆CmYAB3.1基因；构建CmYAB3.1基因植物表达载体；采用农杆菌介导法将其转入菊花中，进行培养初步获得抗性植株。对转化植株进行分子检测证实CmYAB3.1基因已经整合到转基因植株的基因组DNA中并发生转录。对转基因植株进行表型观察与统计分析，发现与未转基因植株相比，转基因植株的高度明显变矮，茎杆变粗。本发明专利技术通过转基因技术调控了菊花株型，获得适合作案头菊的矮壮的植株，为利用基因工程技术调控花卉重要农艺性状，易于轻简化栽培提供新颖而实用的方法，具有较高的应用价值。

A method of creating short and strong plant type Chrysanthemum

【技术实现步骤摘要】
一种创建矮壮株型菊花的方法
本专利技术属于植物基因工程和转基因育种领域，涉及一种通过转基因技术创制矮状株型菊花的方法及其应用。
技术介绍
菊花(Chrysanthemummorifolium)起源于中国，栽培历史悠久，是我国十大传统名花和世界四大切花之一。菊花具有丰富的花色、多样的花姿等特点，深受人们的喜爱。株型直接影响花卉的观赏品质，是育种者关注的主要性状之一。菊花根据用途不同分可为地被菊、切花菊、盆栽菊、案头菊等。育种工作者通过不断的调整栽培方式来调控株型，使之达到不同的用途。其中案头菊要求植株矮，茎秆健壮挺立，株高一般控制在20厘米以内，无分枝。生产上通过缩短营养生长时间，控制氮肥，摘心，使用生长抑制剂等方法来调控株型，耗费人力物力。因此培育出植株矮小，茎秆粗壮的菊花品种将大大降低菊花生产成本，提高效益，增加菊农收入。近年来，随着分子生物学的迅速发展，通过农杆菌介导的遗传转化的技术在植物体内过量表达或定点敲除特定的内源基因以改变作物的农艺性状已成为现代育种的重要手段。相比传统的遗传育种，这种育种方式大大缩短了育种时间、提高了育种效率，为改良菊花品种提供了新的手段和途径。在菊花中通过转基因技术来改变株型的研究还不完善，尤其是创制植株矮小，茎秆粗壮的菊花还未见报道。因此通过农杆菌介导法将菊花的YAB3.1基因导入切花菊‘神马’调控菊花高度是一种新的探索，为采用基因工程技术选育菊花观赏品种提供新颖而实用的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决定向改良菊花株型的问题，提供一种CmYAB3.1基因，该基因的序列为SEQIDNO.1。本专利技术的第二个目的是提供一种CmYAB3.1基因植物表达载体。本专利技术的另一目的在于提供一种通过转CmYAB3.1基因调控菊花株型的方法。本专利技术涉及的农杆菌介导遗传转化，转基因植物的分子检测及转基因植株后代表型观察用于本专利技术，为利用基因工程技术开展观赏性菊花分子育种提供方法和实例。本专利技术的又一目的在于提供CmYAB3.1基因、CmYAB3.1基因植物表达载体、调控菊花株型的方法在调控菊花株型方面的基因工程应用。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：本专利技术的第一个目的是提供一种改变菊花株型的基因CmYAB3.1，该基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的第二个目的是提供一种植物表达载体，所述植物表达载体包含上述基因CmYAB3.1。进一步的，所述植物表达载体是将上述基因CmYAB3.1克隆到过表达载体pORE-R4-35sAA中所得。本专利技术的第三个目的是提供一种调控菊花株型的方法，所述方法包括以下步骤：(1)菊花CmYAB3.1的克隆，获得基因CmYAB3.1；(2)植物表达载体pORE-R4-35sAA-CmYAB3.1的构建：根据CmYAB3.1基因全长序列设计引物，在CmYAB3.1基因的上游和下游引物中分别引入XhoI和SmaI酶切位点，用高保真酶进行PCR反应，然后用限制性内切酶XhoI和SmaI对PCR产物和植物过表达载体pORE-R4-35sAA进行双酶切；酶切产物分别回收，再将其回收产物用连接酶连接后，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒，植物表达载体pORE-R4-35sAA-CmYAB3.1构建成功；(3)农杆菌EHA105介导叶盘法将步骤(2)构建的CmYAB3.1基因植物表达载体转入菊花‘神马’中，进行培养初步获得抗性植株：将步骤(2)获得的植物表达载体pORE-R4-35sAA-CmYAB3.1转化农杆菌感受态细胞EHA105，获得阳性克隆农杆菌，通过叶盘法将基因CmYAB3.1导入菊花，经过卡那霉素抗性筛选得到阳性转化植株，对阳性转化植株进行PCR、荧光定量RT-PCR检测验证CmYAB3.1基因已经插入转基因植株的基因组DNA中并表达，获得阳性转基因菊花株系。进一步的，步骤(1)具体操作为：以切花菊‘神马’的cDNA为模板，根据序列信息设计CmYAB3.1基因正、反向特异引物，以反转录的cDNA为模板，进行PCR扩增，产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞；或根据SEQIDNO.1所示基因序列直接合成，获得SEQIDNO.1所示目的基因的全长序列；所述CmYAB3.1基因正、反向特异引物为：上游引物CmYAB3.1-F：5′-ATGTCTACCATCACAGCCAC-3′(SEQIDNO.2)，下游引物CmYAB3.1-R：5′-CTAATAATAAGGAGAGACACCAAC-3′(SEQIDNO.3)；进一步的，步骤(2)中所述引物为：上游引物CmYAB3.1-XhoI-F：5′-CCGCTCGAGATGTCTACCATCACA-3′(SEQIDNO.4)，下游引物CmYAB3.1-SmaI-R：5′-TCCCCCGGGATAATAAGGAGAGAC-3′(SEQIDNO.5)。进一步的，步骤(3)所述的对阳性转化植株进行PCR、定量RT-PCR检测的过程为：1)PCR检测：取生根筛选得到的卡那霉素抗性植株嫩叶及未转化株嫩叶，提取基因组DNA，将GFP的一段序列和CmYAB3.1的一段序列作为检测目标，在GFP和CmYAB3.1两端设计引物，扩增出的片段长为1029bp，引物序列为：上游引物YAB3.1-GFP-F:5'-AATGATCTTCCTAAGCCACCTGA-3'(SEQIDNO.6)，下游引物YAB3.1-GFP-R:5’-GTATAGTTCATCCATGCCATGTGTA-3’(SEQIDNO.7)；分别以卡那霉素抗性植株和未转化植株DNA为模板，以YAB3.1-GFP-F和YAB3.1-GFP-R为引物，进行PCR检测，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。2)荧光定量RT-PCR检测：提取抗卡那霉素植株叶片及未转化株叶片总RNA，反转录成第一链cDNA，建立荧光定量RT-PCR扩增体系，每个样品重复3次，根据数据分析得到各个样品的CT值，以未转化植株的表达为基准值，计算各转基因植株及野生型基因相对表达情况，特异引物扩增出的片段长为192bp，引物序列为：上游引物CmYAB3.1-RT-F：5′-CAGTTTCATTTCGGTCCTTCTTTA-3′(SEQIDNO.8)，下游引物CmYAB3.1-RT-R：5′-TCTCTGTCTCTTCTCTGGTGCTCT-3′(SEQIDNO.9)；以EF1α扩增的基因片段为内标，片段长度为151bp，引物序列：上游引物EF1α-F：5′-TTTTGGTATCTGGTCCTGGAG-3′(SEQIDNO.10)，下游引物EF1α-R：5′-CCATTCAAGCGACAGACTCA-3′(SEQIDNO.11)。具体的，上述的通过转CmYAB3.1基因调控菊花株系的方法：其在于步骤(3)中所述的采用农杆菌介导本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种改变菊花株型的基因CmYAB3.1，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种改变菊花株型的基因CmYAB3.1，该基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.一种植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体包含权利要求1所述基因CmYAB3.1。


3.根据权利要求2所述的植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体是将权利要求1
所述的基因CmYAB3.1克隆到过表达载体pORE-R4-35sAA中所得。


4.一种调控菊花株型的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)获得基因CmYAB3.1；
(2)植物表达载体pORE-R4-35sAA-CmYAB3.1的构建：根据CmYAB3.1基因全长序列设计引物，并在CmYAB3.1基因的上游和下游引物中分别引入XhoI和SmaI酶切位点，进行PCR扩增，然后用限制性内切酶XhoI和SmaI对PCR产物和植物过表达载体pORE-R4-35sAA进行双酶切；酶切产物分别回收，再将其回收产物用连接酶连接后，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒，植物表达载体pORE-R4-35sAA-CmYAB3.1构建成功；
(3)农杆菌EHA105介导叶盘法转化菊花：将步骤(2)获得的植物表达载体pORE-R4-35sAA-CmYAB3.1转化农杆菌感受态细胞EHA105，获得阳性克隆农杆菌，通过叶盘法将基因CmYAB3.1导入菊花，经过卡那霉素抗性筛选得到阳性转化植株，对阳性转化植株进行PCR、荧光定量RT-PCR检测，验证CmYAB3.1基因已经插入转基因植株的基因组DNA中并表达，获得阳性转基因菊花株系。


5.根据权利要求4所述调控菊花株型的方法，其特征在于，步骤(1)具体操作为：
以切花菊‘神马’的cDNA为模板，根据序列信息设计CmYAB3.1基因正、反向特异引物，进行PCR扩增，产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞；或
根据SEQIDNO.1所示基因序列直接合成，获得SEQIDNO.1所示目的基因的全长序列；
所述CmYAB3.1基因正、反向特异引物为：
上游引物CmYAB3.1-F：5′-ATGTCTACCATCACAGCCAC-3′(SEQIDNO.2)，
下游引物CmYAB3.1-R：5′-CTAATAATAAGGAGAGACACCAAC-3′(SEQIDNO.3)。


6.根据权利要求4所述调控菊花株型的方法，其特征在于，步骤(2)中所述引物为：
上游引物CmYAB3.1-Xho...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈发棣，张雪，丁莲，李松，房伟民，胡月姮，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32