大豆GmTST2.1基因在大豆育种中的应用制造技术

一种大豆GmTST2.1基因在大豆育种中的应用，属于植物生物技术领域。为了大豆高产抗逆新品种的培育，本发明专利技术提供了一种大豆GmTST2.1基因在制备转基因大豆植株中的应用，步骤如下：克隆大豆GmTST2.1基因；所述GmTST2.1基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；将GmTST2.1基因构建到表达载体中，获得重组载体，然后导入大豆中，获得转基因植株。过表达GmTST2.1基因能显著增加可溶性糖含量、生物学产量以及经济产量，并提高大豆抗旱能力，本发明专利技术可用于大豆高产抗逆新品种开发。

Application of gmtst2.1 gene in Soybean Breeding

【技术实现步骤摘要】
大豆GmTST2.1基因在大豆育种中的应用
本专利技术涉及一种大豆GmTST2.1基因在大豆育种中的应用，属于植物生物

技术介绍
大豆是全世界广泛种植的重要食用蛋白质和油料作物，其研究的主要任务是培育优质高产的新品种大豆。种子作为大豆的重要经济产物，在它的发育过程中需要很多的光合产物运输到库。光合产物向库运输的形式主要为蔗糖。因此，大豆产量和品质的形成与高效蔗糖运输密切相关。作物光合作用合成的大多数蔗糖通过韧皮部的运输最终卸载到库组织，在其运输途中糖转运蛋白发挥了关键作用。液泡膜糖转运蛋白TST(TonoplastSugarTransporter)在糖转运过程中起重要作用，可把“源”中的碳水化合物转运到“库”中，从而增强库势，促进作物产量形成。
技术实现思路
为了大豆高产、抗逆新品种的培育，本专利技术提供了一种大豆GmTST2.1基因在制备转基因大豆植株中的应用，步骤如下：1)克隆大豆GmTST2.1基因；所述GmTST2.1基因核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；2)将GmTST2.1基因构建到表达载体中，获得重组载体；3)将重组载体导入大豆中，获得转基因植株。进一步地限定，步骤2)所述的表达载体为pCambia3300。进一步地限定，步骤3)所述大豆品种为黑河43。进一步地限定，步骤3)所述重组载体通过农杆菌介导法转化大豆。进一步地限定，所述农杆菌为EHA105。本专利技术还提供了大豆GmTST2.1基因在富含可溶性糖大豆品种育种中的应用，所述GmTST2.1基因核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术还提供了大豆GmTST2.1基因在大豆抗旱品种育种中的应用，所述GmTST2.1基因核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。有益效果本专利技术克隆了GmTST2.1，并证明该基因能够参与到大豆产量的相关进程中，过表达该基因可显著提高大豆的株高、百粒重和可溶性糖含量，生物学产量以及经济产量，与野生型相比，过表达GmTST2.1基因大豆株高增加14％，百粒重增加8.2％，蛋白质和脂肪含量变化不显著而可溶性糖含量明显升高，且为野生型的1.83倍，生物学产量增加87％，且该基因具有明显的抵抗干旱的功能，将得到的转基因材料通过之后的继代繁殖及鉴定，可以成为稳定的高产遗传材料。本专利技术为大豆高产抗逆新品种的培育提供优良基因资源和新材料。附图说明图1RNA和PCR产物电泳结果，左图中1-2为Williams82RNA，右图中3为GmTST2.1目的条带，M为标准分子量2000，从上至下，大小依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；图2GmTST2.1基因表达载体的构建，M：DL15000；A：双酶切鉴定，其中1：阳性重组质粒，2：双酶切产物；B：转化农杆菌菌液PCR鉴定，其中1：阳性重组质粒，2：阴性质粒对照，3：水对照，4-7：PCR产物；图3T1代转基因大豆的PCR检测，M：DL2000；A：Bar引物的PCR鉴定；B：特异性引物的PCR鉴定；1均为阳性对照，2均为阴性对照，3均为水；4-14分别为PCR产物；图4T1代转GmTST2.1基因大豆植株的qRT-PCR检测，1-10为转基因植株；ck为野生型植株；图5T1代转GmTST2.1大豆植株半定量RT-PCR检测，其中ck1为空白对照；ck2为阴性对照；1-7为PCR产物；图6转GmTST2.1大豆植株免疫印迹检测，其中CK为野生型；1-5为转GmTST2.1基因植株；图7T1代转GmTST2.1基因大豆植株株高变化，1-3：转基因植株；CK：野生型植株；图8转基因植株与野生型植株在干旱胁迫7d的生理指标测定，OE1-OE3代表3个T1代转基因株系，WT代表野生型黑河43；“*”和“**”分别代表在0.05和0.01水平差异显著；图9自然干旱条件下GmTST2.1基因过表达植株与野生型长势对比。具体实施方式提取植物RNA和DNA纯化回收实验用品由Omega公司提供；反转录实验用品由上海捷瑞公司提供。TaqDNA聚合酶、DNAMarker、TrizolReagent、T4DNA连接酶、PGEM-TEasyVector克隆试剂盒、限制性内切酶均由ThermoFisherScientific公司提供。其余实验试剂以及仪器设备如无特殊说明，均可通过商业化途径购买获得。所述大豆品种williams82、黑河43均为本领域公知的大豆品种，可通过商业化途径购买。实施例1.转GmTST2.1基因大豆植株的构建。1、GmTST2.1基因的克隆1)总RNA提取(Trizol法)①用剪子剪取williams82的嫩叶放入1.5ml的离心管中，迅速放入液氮盒冷冻研磨，向离心管中加入1mLTrisol提取液，颠倒混匀，静止5min；②加入200uL氯仿，颠倒混匀，静置3-5min后4℃12000r/min离心15min；③抽取上清放至新离心管，加入等体积的异丙醇，均匀振荡2-3min，4℃静止20-30min；④4℃12000r/min离心10min；⑤去上清，加入1mL75％乙醇(将无水乙醇用DEPC水进行稀释)，振荡后4℃12000r/min离心10min；⑥重复第⑤步一次；⑦去上清，空离2min，用移液器吸除残留上清，置于冰上干燥；⑧待干燥之后加入20ulDEPC水溶解及凝胶电泳检验质量。2)总RNA反转录表1反转录反应体系及程序如下根据定量结果选出主拷贝基因序列，设计一对包括有起始密码和终止密码的5’端及3’端引物，并且引入合适酶切位点。GmTST2.1基因克隆的引物：GmTST2.1-FCATGGGATTACGAAACTAACTGAAACGGmTST2.1-RGGTTACCGAATTTATCATGTCCTTGGG克隆PCR反应体系参考试剂盒说明书。PCR反应条件为：94℃预变性10min，94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸30s，扩增适当次数；72℃延伸10min，得到该基因全长CDS2205bp序列(图1)，将目的基因经回收、转化，取阳性克隆进行测序，测序结果与Phytozme数据库中目的序列进行比对，结果与参考序列完全一致。置于4℃保存。2、GmTST2.1基因的载体构建将带有目的基因的PCR产物回收，参照试剂盒说明书将回收产物与PGEM-TEasy载体连接过夜，连接体系10μL：1μLPGEM-TEasyVector，1μLT4DNALigase，1μL10xT4DNALigaseBuffer，5μLPCR产物，水。连接产物转化大肠杆菌Trans-T1，然后在LB固体培养基上筛选，LB固体培养基含卡纳抗性。选取阳性菌株进行基因测序。将测序正确的菌株进行下步的酶切反应。用S本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.大豆GmTST2.1基因在制备转基因大豆植株中的应用，其特征在于，步骤如下：/n1)克隆大豆GmTST2.1基因；所述GmTST2.1基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；/n2)将GmTST2.1基因构建到表达载体中，获得重组载体；/n3)将所述重组载体导入大豆中，获得转基因植株。/n

【技术特征摘要】
1.大豆GmTST2.1基因在制备转基因大豆植株中的应用，其特征在于，步骤如下：
1)克隆大豆GmTST2.1基因；所述GmTST2.1基因核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；
2)将GmTST2.1基因构建到表达载体中，获得重组载体；
3)将所述重组载体导入大豆中，获得转基因植株。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤2)所述的表达载体为pCambia3300。


3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤3)所述大豆品种...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩英鹏，赵雪，张永艳，董海冉，战宇航，滕卫丽，李文滨，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙;23