用于合成具有预先确定的序列的核酸的方法技术

本申请涉及核酸的化学合成。本申请提供了一种合成各自独立地具有预先确定的序列的n种(n≥2)目标核酸分子的方法。

A method for the synthesis of nucleic acids with predetermined sequences

【技术实现步骤摘要】
用于合成具有预先确定的序列的核酸的方法
本申请涉及生物化学领域。特别地，本申请涉及具有预先确定的序列的核酸分子的化学合成。本申请提供了一种合成各自独立地具有预先确定的序列的n种(n≥2)目标核酸分子的方法。背景自二十世纪五十年代Todd，Khorana课题组第一次报道了DNA合成(Michelwn,A.M.,Todd,A.R.J.Chem.Soc.,1955；Gilham,P.T.,Khorana,H.G.,J.A.m.Cliem.Soc.,1958)以来，DNA的合成方法经历了长期的发展。目前经典的合成方法包括：八十年代发展起来的柱式合成法，以及九十年代发展起来的基于微阵列的高通量合成法。这些方法基本上为固相合成法，其中，以单个脱氧核糖核苷酸为单元进行合成，并且其合成过程大多涉及基于亚磷酰胺化学的四步骤循环：即脱保护、偶联、加帽和氧化步骤。由于每一步反应的不完全性、伴随可能发生的副反应(如脱腺苷等)以及反应物浓度随反应进展的降低，随着DNA单链的延长，DNA合成的错误率急剧上升，产量急剧下降。此外，柱式合成法的缺点还在于试剂使用量大且通量低，导致合成成本较高，费时费力。而基于微阵列的合成方法虽然通量较高且试剂使用量少，但是其错误率相对较高，产量低，且不稳定。目前，一些商业化的DNA合成仪已经进入市场。根据上述合成原理，这些合成仪相应地可以分为两种：柱式合成仪(例如Dr.Oligo192和Mermade192)和微阵列合成仪(例如CustomArray合成仪)。柱式合成仪使用电磁阀来控制试剂的添加，在尺寸为厘米级别的多孔反应柱上进行固相合成反应。微阵列合成仪则是在微米级别的反应孔内进行固相合成反应。通过在一张芯片上设置成千上万个反应孔，微阵列合成仪大大提高了合成通量，且在一定程度上减少了试剂的消耗；然而，其缺点是产量低，反应不易控制，且错误率较高。此外，当使用微阵列合成仪合成DNA时，所获得的产物通常为混合物，难以对不同的DNA分子进行分离和纯化，这也增加了后续操作的成本。在RNA的化学合成中，核糖核苷的5’-OH、糖环外的氨基及磷酸羟基的保护与DNA基本相同。因此，RNA的化学合成可使用上述DNA合成仪(柱式合成仪和微阵列合成仪)来进行。但是，由于核糖核苷酸的糖环上包含两个羟基(2’-OH和3’-OH)，因此，在RNA合成过程中，需要进行额外的步骤，即对糖环上的2’-OH进行保护和脱保护。与DNA的化学合成类似，由于每一步反应的不完全性、伴随可能发生的副反应以及反应物浓度随反应进展的降低，常见的RNA化学合成方法也具有下述缺点：随着单链RNA长度的增加，合成的错误率急剧上升，产量急剧下降。这导致了DNA和RNA合成产物的长度和产量受到了极大的限制。类似地，当使用柱式合成仪合成RNA时，合成通量低而且试剂利用率低，这导致合成成本较高，费时费力。当使用微阵列合成仪合成RNA时，尽管合成通量有所提高，但是其错误率相对较高，产量低，并且所获得的产物通常为混合物，难以对不同的核酸分子进行分离和纯化。另外，从进样方式方上来说，在合成DNA和RNA过程中，柱式合成仪和微阵列合成仪均通过预先铺设的管线，将试剂加载到合成柱或者合成芯片上，且加入的试剂大大过量，这造成了试剂的极大浪费和低试剂使用率。此外，试剂输入和输出管线的单独铺设也进一步增加了合成成本。总的来说，核酸合成的化学合成方法仍存在着缺陷，本领域需要开发新的低成本、低错误率和高通量的合成方法。
技术实现思路
在本申请中，除非另有定义，否则本文所用的全部技术和科学术语都具有本申请所属领域普通技术人员所通常理解的含义。在本申请的实施方案中，可以使用与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料，下文仅仅是描述了例示性的适合的方法和材料。将所有公开出版物、专利申请、专利和其它参考文献并入本文作为参考。此外，所述材料、方法和实施例仅仅是示范性的而非限制性的。同时，为了更好地理解本专利技术，本申请中也提供了相关术语的定义和解释。当本申请中提供的术语定义和解释与本申请所属领域普通技术人员所通常理解的意思相冲突时，以本申请提供的术语定义和解释为准。本申请专利技术人经过一系列研究，开发了一种新的低成本、低错误率和高通量的核酸合成方法。简言之，本专利技术提出了一种基于识别-分选策略的合成核酸的方法。本专利技术的合成核酸的方法涉及了识别-分选策略以及“合成池”浸泡策略，能够精确控制合成过程，灵活控制合成通量，并且能够实现对合成试剂的循环利用。由此，除了能够实现灵活控制通量之外，本专利技术的方法及装置还极大降低了物料成本，缩短了每步化学反应的时间，而且优化了整个合成流程，降低了错误率，提高了合成效率。合成方法因此，在第一方面，本申请提供了一种合成n种核酸分子的方法，其中，所述n种核酸分子各自具有预先确定的序列，n为≥2的整数，所述方法包括以下步骤：(1)提供n个固相载体，其中，每一个固相载体各自独立地携带编码，并且，每一个固相载体与其所携带的编码具有唯一对应关系；并且，每一个固相载体被确定用于合成一种核酸分子，并且携带用于起始核酸合成的化学基团(例如端部基团)；(2)提供：-多个合成池，每一个合成池各自独立地含有反应试剂，所述反应试剂能够将一个构建单元连接至固相载体上携带的化学基团，其中，所述构建单元选自具有5’-保护基的亚磷酰胺单体或低聚体(例如二聚体、三聚体或四聚体)；并且，每一个合成池对应于一种构建单元；所述多个合成池的集合至少涵盖了所述n种核酸分子所包含的构建单元的所有种类；-至少一个洗涤池，其包含洗涤剂；-至少一个盖帽池，其包含盖帽试剂；-至少一个氧化池，其包含氧化试剂；以及-至少一个脱保护池，其包含脱保护试剂；(3)将所有固相载体接触浸泡入盖帽池，并与其中的盖帽试剂反应；然后，将该固相载体浸泡入洗涤池，用洗涤剂洗涤，以去除固相载体上残留的反应试剂；(4)将所有固相载体浸泡入脱保护池，并与其中的脱保护试剂反应；然后，将该固相载体浸泡入洗涤池，用洗涤剂洗涤，以去除固相载体上残留的反应试剂；(5)识别每一个固相载体携带的编码，并根据编码与固相载体的唯一对应关系，以及每一个固相载体待合成的目标核酸的序列，确定每一个固相载体待连接的构建单元的种类；(6)根据前一步骤确定的待连接的构建单元的种类，分选每一个固相载体，并使每一个固相载体浸泡入对应于所述种类的构建单元的合成池并进行反应，从而将一个所述种类的构建单元连接至所述固相载体上携带的化学基团；然后，将所有固相载体浸泡入洗涤池，用洗涤剂洗涤，以去除固相载体上残留的反应试剂；(7)将所有固相载体浸泡入盖帽池，并与其中的盖帽试剂反应；然后，将该固相载体浸泡入洗涤池，用洗涤剂洗涤，以去除固相载体上残留的反应试剂；(8)将所有固相载体浸泡入氧化池，并与其中的氧化试剂反应；然后，将所有固相载体浸泡入洗涤池，用洗涤剂洗涤，以去除固相载体上残留的反应试剂；(9)任选地，重复步骤(4)-(8)一次或多次；从而，在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种合成n种核酸分子的方法，其中，所述n种核酸分子各自具有预先确定的序列，n为≥2的整数，所述方法包括以下步骤：/n(1)提供n个固相载体，其中，每一个固相载体各自独立地携带编码，并且，每一个固相载体与其所携带的编码具有唯一对应关系；并且，每一个固相载体被确定用于合成一种核酸分子，并且携带用于起始核酸合成的化学基团；/n(2)提供：/n-多个合成池，每一个合成池各自独立地含有反应试剂，所述反应试剂能够将一个构建单元连接至固相载体上携带的化学基团，其中，所述构建单元选自具有5’-保护基的亚磷酰胺单体或低聚体；并且，每一个合成池对应于一种构建单元；所述多个合成池的集合至少涵盖了所述n种核酸分子所包含的构建单元的所有种类；/n-至少一个洗涤池，其包含洗涤剂；/n-至少一个盖帽池，其包含盖帽试剂；/n-至少一个氧化池，其包含氧化试剂；以及/n-至少一个脱保护池，其包含脱保护试剂；/n(3)将所有固相载体浸泡入盖帽池，并与其中的盖帽试剂反应；然后，将该固相载体浸泡入洗涤池，用洗涤剂洗涤，以去除固相载体上残留的反应试剂；/n(4)将所有固相载体浸泡入脱保护池，并与其中的脱保护试剂反应；然后，将该固相载体浸泡入洗涤池，用洗涤剂洗涤，以去除固相载体上残留的反应试剂；/n(5)识别每一个固相载体携带的编码，并根据编码与固相载体的唯一对应关系，以及每一个固相载体待合成的目标核酸的序列，确定每一个固相载体待连接的构建单元的种类；/n(6)根据前一步骤确定的待连接的构建单元的种类，分选每一个固相载体，并使每一个固相载体浸泡入对应于所述种类的构建单元的合成池并进行反应，从而将一个所述种类的构建单元连接至所述固相载体上携带的化学基团；然后，将所有固相载体浸泡入洗涤池，用洗涤剂洗涤，以去除固相载体上残留的反应试剂；/n(7)将所有固相载体浸泡入盖帽池，并与其中的盖帽试剂反应；然后，将该固相载体浸泡入洗涤池，用洗涤剂洗涤，以去除固相载体上残留的反应试剂；/n(8)将所有固相载体浸泡入氧化池，并与其中的氧化试剂反应；然后，将所有固相载体浸泡入洗涤池，用洗涤剂洗涤，以去除固相载体上残留的反应试剂；/n(9)任选地，重复步骤(4)-(8)一次或多次；/n从而，在固相载体上合成具有预先确定序列的n种核酸分子；/n优选地，所述方法还包括下述步骤：(10)对固相载体进行氨解反应，然后收集、纯化从固相载体分离的核酸分子；/n优选地，在步骤(10)中，在进行氨解反应之前，先利用编码对固相载体进行分选，以获得具有期望核酸分子的固相载体；或者，将所有固相载体混合在一起，并进行氨解反应，从而收集获得含有至少两种核酸分子的文库。/n...

【技术特征摘要】
20181115 CN 20181135600711.一种合成n种核酸分子的方法，其中，所述n种核酸分子各自具有预先确定的序列，n为≥2的整数，所述方法包括以下步骤：
(1)提供n个固相载体，其中，每一个固相载体各自独立地携带编码，并且，每一个固相载体与其所携带的编码具有唯一对应关系；并且，每一个固相载体被确定用于合成一种核酸分子，并且携带用于起始核酸合成的化学基团；
(2)提供：
-多个合成池，每一个合成池各自独立地含有反应试剂，所述反应试剂能够将一个构建单元连接至固相载体上携带的化学基团，其中，所述构建单元选自具有5’-保护基的亚磷酰胺单体或低聚体；并且，每一个合成池对应于一种构建单元；所述多个合成池的集合至少涵盖了所述n种核酸分子所包含的构建单元的所有种类；
-至少一个洗涤池，其包含洗涤剂；
-至少一个盖帽池，其包含盖帽试剂；
-至少一个氧化池，其包含氧化试剂；以及
-至少一个脱保护池，其包含脱保护试剂；
(3)将所有固相载体浸泡入盖帽池，并与其中的盖帽试剂反应；然后，将该固相载体浸泡入洗涤池，用洗涤剂洗涤，以去除固相载体上残留的反应试剂；
(4)将所有固相载体浸泡入脱保护池，并与其中的脱保护试剂反应；然后，将该固相载体浸泡入洗涤池，用洗涤剂洗涤，以去除固相载体上残留的反应试剂；
(5)识别每一个固相载体携带的编码，并根据编码与固相载体的唯一对应关系，以及每一个固相载体待合成的目标核酸的序列，确定每一个固相载体待连接的构建单元的种类；
(6)根据前一步骤确定的待连接的构建单元的种类，分选每一个固相载体，并使每一个固相载体浸泡入对应于所述种类的构建单元的合成池并进行反应，从而将一个所述种类的构建单元连接至所述固相载体上携带的化学基团；然后，将所有固相载体浸泡入洗涤池，用洗涤剂洗涤，以去除固相载体上残留的反应试剂；
(7)将所有固相载体浸泡入盖帽池，并与其中的盖帽试剂反应；然后，将该固相载体浸泡入洗涤池，用洗涤剂洗涤，以去除固相载体上残留的反应试剂；
(8)将所有固相载体浸泡入氧化池，并与其中的氧化试剂反应；然后，将所有固相载体浸泡入洗涤池，用洗涤剂洗涤，以去除固相载体上残留的反应试剂；
(9)任选地，重复步骤(4)-(8)一次或多次；
从而，在固相载体上合成具有预先确定序列的n种核酸分子；
优选地，所述方法还包括下述步骤：(10)对固相载体进行氨解反应，然后收集、纯化从固相载体分离的核酸分子；
优选地，在步骤(10)中，在进行氨解反应之前，先利用编码对固相载体进行分选，以获得具有期望核酸分子的固相载体；或者，将所有固相载体混合在一起，并进行氨解反应，从而收集获得含有至少两种核酸分子的文库。


2.权利要求1所述的方法，其中，所述具有5’-保护基的亚磷酰胺单体或低聚体选自5'-羟基被DMT保护、3’-羟基被亚磷酰胺保护的脱氧核糖核苷酸单体或低聚体；或者，所述具有5’-保护基的亚磷酰胺单体或低聚体选自5'-羟基被DMT保护、2'-羟基被TBDMS(叔丁基甲基硅基醚)保护、3’-羟基被亚磷酰胺保护的核糖核苷酸单体或低聚体；
优选地，所述低聚体是二聚体、三聚体或四聚体。


3.权利要求1或2所述的方法，其中，所述洗涤剂是乙腈。


4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中，所述盖帽试剂包含第一试剂和第二试剂，其中所述第一试剂包含乙酸酐/吡啶/四氢呋喃混合物，所述第二试剂包含氮-甲基咪唑的乙腈溶液；
优选地，乙酸酐、吡啶和四氢呋喃的体积比为1:1:1至1:5:10，例如1:1:1至1:1:10；优选地，乙酸酐、吡啶和四氢呋喃的体积比为1:1:8；
优选地，所述第二试剂包含氮-甲基咪唑的乙腈溶液；
优选地，所述溶液中氮-甲基咪唑的浓度为10％-20％w/v，例如15％-20％w/v；优选地，氮-甲基咪唑的浓度为17％-18％w/v，例如17.6％w/v；
优选地，所述第一试剂和第二试剂的体积比为1:1至1:2，进一步优选为1:1。


5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中，所述氧化试剂包括碘溶液；
优选地，所述碘溶液是碘在水/吡啶/四氢呋喃混合物中的溶液；
优选地，水、吡啶和四氢呋喃的体积比为2:10:88至5:25:70，其中，三者体积分数之和为100％；优选地，水、吡啶和四氢呋喃的体积比为2:20:78；
优选地，所述碘溶液中碘的浓度为0.01-0.1M...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪建，徐讯，汪军，沈玥，倪鸣，章文蔚，李汉东，王勇，江湘儿，张焕贵，胡书环，冯利鹤，孙宝策，黄小罗，周超，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，深圳华大基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44