【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】涉及检测重组事件和重排事件的方法和组合物相关申请的交叉引用根据35U.S.C.§119(e),本申请要求2017年2月13日递交的美国临时申请No.62/458,244的权益,以引用的方式将其内容整体并入本文。政府支持本专利技术是在由美国国立卫生研究院授予的基金号AI020047的政府支持下完成的。美国政府对本专利技术享有一定的权利。序列表本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表,并在此以引用的方式将其整体并入。所述ASCII副本(创建于2018年2月9日)被命名为701039-086701-PCT_SL.txt,大小为16,157字节。
本文描述的技术涉及通过基于高通量全基因组易位测序(highthroughput,genome-widetranslocationsequencing,HTGTS)的方法检测细胞中的重组事件和/或重排事件(例如V(D)J重组)。
技术介绍
V(D)J重组事件的鉴定和表征在帮助理解免疫系统以及开发和优化基于抗体的治疗剂方面都是令人感兴趣的。现有的基于DNA的检测V(D)J重组的方法依赖于使用上游简并V引物和下游简并J引物,其可以覆盖大多数(但并非全部)V(D)J外显子并对可能的外显子提供不均等的覆盖。此外,此类方法仅检测两条引物之间的重排序列,因此不会发现对于大多数脱靶序列的RAG生成的接合(joins)。基于RNA的方法严重低估了由于转录水平降低导致的非生产性重排,并且由于缺乏表达而错过了基因座内的许多脱靶重排。专利技 ...
【技术保护点】
1.一种用于细胞中重组事件和/或重排事件的基于高通量全基因组易位测序(HTGTS)的检测方法,所述方法包括以下步骤:/na.从细胞中提取基因组DNA和/或mRNA;/nb.任选地,产生片段化的DNA和/或mRNA样品;/nc.用至少一条第一基因座特异性引物通过线性扩增介导的PCR(LAM-PCR)由基因组DNA产生单链PCR产物;和/或/n用至少一条第一基因座特异性引物通过逆转录由mRNA产生cDNA;/nd.通过将步骤(c)中产生的所述单链PCR产物或cDNA连接至衔接子,来产生连接的DNA和/或cDNA产物,其中,所述衔接子包含:/n已知DNA序列的远端部分,所述已知DNA序列的远端部分可用来设计用于巢式PCR扩增的PCR引物;/n随机核苷酸的近端部分;和/n3'突出;/ne.使用步骤(d)的所述连接产物,通过用衔接子特异性引物和至少一条第二基因座特异性引物进行巢式PCR以产生巢式PCR产物,从而扩增包含所述重组事件和/或重排事件的核酸序列;/nf.任选地,用限制酶对步骤(e)的所述PCR产物进行消化以阻断未重排的含诱饵片段;/ng.通过对所述巢式PCR产物进行测序以产生经测序的巢 ...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170213 US 62/458,2441.一种用于细胞中重组事件和/或重排事件的基于高通量全基因组易位测序(HTGTS)的检测方法,所述方法包括以下步骤:
a.从细胞中提取基因组DNA和/或mRNA;
b.任选地,产生片段化的DNA和/或mRNA样品;
c.用至少一条第一基因座特异性引物通过线性扩增介导的PCR(LAM-PCR)由基因组DNA产生单链PCR产物;和/或
用至少一条第一基因座特异性引物通过逆转录由mRNA产生cDNA;
d.通过将步骤(c)中产生的所述单链PCR产物或cDNA连接至衔接子,来产生连接的DNA和/或cDNA产物,其中,所述衔接子包含:
已知DNA序列的远端部分,所述已知DNA序列的远端部分可用来设计用于巢式PCR扩增的PCR引物;
随机核苷酸的近端部分;和
3'突出;
e.使用步骤(d)的所述连接产物,通过用衔接子特异性引物和至少一条第二基因座特异性引物进行巢式PCR以产生巢式PCR产物,从而扩增包含所述重组事件和/或重排事件的核酸序列;
f.任选地,用限制酶对步骤(e)的所述PCR产物进行消化以阻断未重排的含诱饵片段;
g.通过对所述巢式PCR产物进行测序以产生经测序的巢式PCR产物;以及
h.将所述经测序的巢式PCR产物与参比序列或抗原受体数据库进行比对。
2.如权利要求1所述的方法,其中,所述重组事件为V(D)J重组事件。
3.一种用于细胞中Ig组库序列的基于高通量组库测序的检测方法,所述方法包括以下步骤:
a.从细胞中提取基因组DNA和/或mRNA;
b.任选地,产生片段化的DNA和/或mRNA样品;
c.用至少一条第一基因座特异性引物通过线性扩增介导的PCR(LAM-PCR)由基因组DNA产生单链PCR产物;和/或
用至少一条第一基因座特异性引物通过逆转录由mRNA产生cDNA;
d.通过将步骤(c)中产生的所述单链PCR产物或cDNA连接至衔接子,以产生连接的DNA和/或cDNA产物,其中,所述衔接子包含:
已知DNA序列的远端部分,所述已知DNA序列的远端部分可用来设计用于巢式PCR扩增的PCR引物;
随机核苷酸的近端部分;和
3'突出;
e.使用步骤(d)的所述连接产物,通过用衔接子特异性引物和至少一条第二基因座特异性引物进行巢式PCR以产生巢式PCR产物,从而扩增包含所述Ig组库序列的核酸序列;
f.任选地,用限制酶消化步骤(e)的所述PCR产物以阻断未重排的含诱饵片段;
g.通过对所述巢式PCR产物进行测序以产生经测序的巢式PCR产物;以及
h.将所述经测序的巢式PCR产物与参比序列或抗原受体数据库进行比对。
4.如权利要求3所述的方法,其中,所检测的组库包含V(D)J重组事件和/或体细胞超突变(SMH)。
5.如权利要求3或4所述的方法,其中,所检测的组库包括Ig重链组库、Ig轻链组库、V使用组库以及CDR3组库。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法,其中,所述细胞选自于由以下细胞所组成的组:
成熟B淋巴细胞、发育中的B淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、发育中的T淋巴细胞、从生发中心获得的细胞、以及从派伊尔氏结获得的细胞。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法,其中,所述方法进一步包括提供所述细胞,其中,所述细胞获得自用抗原免疫的动物。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法,其中,所述方法进一步包括提供所述细胞,其中,所述细胞包含经历过体细胞超突变的V(D)J外显子。
9.如权利要求8所述的方法,其中,所述细胞为生发中心B淋巴细胞或派伊尔氏结B淋巴细胞。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法,在进行步骤(a)之前,所述方法进一步包括以下步骤:
用抗原免疫动物;以及
从所述动物获得细胞。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法,其中,所述至少一条第一基因座特异性引物特异性地退火至J基因区段。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法,其中,所述方法进一步包括使用多条第一基因座特异性引物和/或多条第二基因座特异性引物。
13.如权利要求12所述的方法,其中,所述多条引物中的各条特异性地退火至不同的V基因区段、D基因区段和/或J基因区段。
14.如权利要求13所述的方法,其中,所述多条引物中的各条特异性地退火至各自不同的J基因区段,所述J基因区段存在于V(D)J重组之前的细胞或有机体的基因组中。
15.如权利要求14所述的方法,其中,所述多条引物共同特异性地退火至JH1、JH2、JH3或JH4各自的序列。
16.如权利要求14所述的方法,其中,所述多条引物共同特异性地退火至JH基因区段、JK基因区段和JL基因区段各自的至少一个序列,所述JH基因区...
【专利技术属性】
技术研发人员:弗雷德里克·W·阿尔特,胡佳志,雪莉·林,杜洲,张宇,陈欢,
申请(专利权)人:儿童医疗中心有限公司,
类型:发明
国别省市:美国;US
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