模拟血浆cfDNA及制备方法和测序文库的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种模拟血浆cfDNA及制备方法和测序文库的构建方法。该模拟血浆cfDNA的制备方法包括：提供培养细胞，利用消化液对所述细胞进行破碎处理，分离获得含有基因组DNA的样本；利用亚特兰提斯双链DNA酶对所述含有基因组DNA的样本进行酶切处理，以便获得所述模拟血浆cfDNA。通过该方法获得的模拟血浆cfDNA具有和天然血浆cfDNA相似的片段大小、分布和序列复杂度，而且制备方法简单，不需要片段化仪器，节约仪器成本。

Simulated plasma cfdna and its preparation and construction of sequencing Library

【技术实现步骤摘要】
模拟血浆cfDNA及制备方法和测序文库的构建方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种模拟血浆cfDNA及制备方法和测序文库的构建方法。
技术介绍
据全球癌症统计，2018年世界范围新发癌症病例为1810万，新增死亡病例960万，癌症已成为人类的第一杀手。伴随癌症的发病率和死亡率的增长，科技创新和基因检测水平的发展，癌症的分子筛查、基因辅助治疗也日益成为当代科学家和各个科研机构的研究热点和精准用药的重要辅助手段。液体活检技术正日益成为实验室检测癌症分子的主要手段，相较于组织活检经常存在的样本不足，取样异质性等问题，血浆ctDNA的液体活检具有的取样便利性和非入侵性等优势，也越来越受到癌症患者和医学研究者的青睐。但是血浆ctDNA液体活检也存在一些技术上的挑战，最重要的是需要建立一套完整的实验体系和生信分析，并经过严格的性能验证，从而能保证更低频率的突变信息被稳定、可重复的检出。这也需要一种可以稳定制备、长期保存、性能稳定、突变覆盖率高的模拟血浆cfDNA。如何获得性能稳定的、与天然cfDNA性能接近的模拟血浆cfDNA，还需要进一步改进。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种具模拟血浆cfDNA及制备方法和测序文库的构建方法。模拟人血浆cfDNA质量主要取决于以下三个特性：一是DNA大小和分布，血浆DNA的非常重要的一个属性就是平均大小为170bp，模拟血浆必须具备和天然血浆相似的大小和分布；二是稳定性和功能，常用的模拟血浆cfDNA的方法是使用癌症细胞系的基因组DNA，直接将其稀释到正常人血浆DNA中，或者经过超声打断后再稀释到正常人血浆中，这种方法得到的模拟cfDNA往往DNA分布范围较天然cfDNA广，这样导致许多DNA无法进行后续的连接扩增，不能被整合到建库中，天然cfDNA寿命较短，由于血浆中存在的蛋白和其它分子，简单混合DNA和血浆无法得到稳定的混合物，DNA降解的很快，无法用于长期的、稳定的实验性能检测，模拟血浆DNA需要具备可以长期稳定制备、保存，具有接近天然cfDNA连接性能、扩增性能等；三是突变覆盖率，临床上对液体活检检出的突变类型和突变点数量越来越多，实验室必须有具有检测最广范围的突变位点和突变类型的能力和信心，因此也需要构建包含更多的突变位点的样本用于性能验证。目前制备模拟cfDNA产品的方法主要有机械打断、人工合成质粒和非特异性酶切打断等方法。机械打断是目前使用的较多的一种模拟cfDNA的方法，其是通过机械振动和超声打断制备获得，实验原理为采用机械振动或声波震动方式破碎较完整的基因组DNA，使其片段化，和人体中通过相关酶作用形成cfDNA的方式截然不同。其缺点是机械打断形成的DNA片段末端与天然cfDNA片段差异大，后续实验中存在检测下限低、背景噪音高、假阳性率高、不利于自动化等缺点。人工合成质粒：其缺点是序列复杂度远低于天然cfDNA，无法模拟天然cfDNA的核酸特点。而采用非特异性酶切打断，通过利用非特异性的核酸内切酶处理gDNA，产生类似cfDNA的片段化DNA，其缺点是多数核酸酶对碱基位点存在偏好性，DNA片段化程度取决于样本质量，模拟得到的血浆cfDNA与天然的血浆cfDNA偏差较大。本专利技术的专利技术人通过研究发现：一种新型的模拟cfDNA酶制剂，可以用来特异的切割双链DNA分子的磷酸二酯键来产生带有5’磷酸基团和3’羟基末端的短链DNA，而且没有AU或AT富集区的切割的偏好性。由此可以制备具有高复杂度、高灵敏性的近似天然血浆cfDNA。具体而言，本专利技术提供了如下技术方案：在本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种制备模拟血浆cfDNA的方法，包括：提供培养细胞，利用消化液对所述细胞进行破碎处理，分离获得含有基因组DNA的样本；利用亚特兰提斯双链DNA酶对所述含有基因组DNA的样本进行酶切处理，以便获得所述模拟血浆cfDNA。亚特兰提斯双链DNA酶(AtlantisdsDNase)是一种特异的双链DNA内切酶，能特异的切割双链DNA分子的磷酸二酯键来产生带有5’磷酸基团和3’羟基末端的短链DNA，而且没有AU或AT富集区的切割的偏好性。应用亚特兰提斯双链DNA酶进行酶切处理，能够制备具有高复杂度、高灵敏性的近似天然血浆cfDNA，该方法能够为医学实验室和科研机构带来可以大量制备、性能稳定的模拟血浆cfDNA，并能减少实验室研发成本和缩短实验研发周期。而且由于制备方法简单，成本较低，而且适合自动化和工业生产。根据本专利技术的实施例，以上所述制备模拟血浆cfDNA的方法可以进一步包括如下技术特征：在本专利技术的一些实施例中，所述酶切处理的温度为37～42摄氏度，优选为42摄氏度。在该温度下进行酶切处理，能够提高酶切的效率，增加目标模拟cfDNA的得率。在本专利技术的一些实施例中，每106个细胞需要亚特兰提斯双链DNA酶的用量为1U以上。由此可以提高酶切的效率，增加目标模拟cfDNA的得率。在本专利技术的一些实施例中，所述酶切处理的时间为20～60分钟。在本专利技术的一些实施例中，所述模拟血浆cfDNA中大小在80～220bp的核酸占比在70％以上。在本专利技术的一些实施例中，所述细胞为携带基因突变的细胞株或野生型细胞株。在本专利技术的一些实施例中，进一步包括：将通过携带基因突变的细胞株所获得的模拟血浆cfDNA以及通过携带野生型细胞株所获得的模拟血浆cfDNA按照预定比例混合，以便获得cfDNA标准品。在本专利技术的第二方面，本专利技术提供了一种模拟血浆cfDNA，所述模拟血浆cfDNA通过本专利技术第一方面任一实施例所述的方法获得。在本专利技术的一些实施例中，所述模拟血浆cfDNA中大小在80～220bp的核酸占比在70％以上。具体来说，在500bp以内，人天然cfDNA中160-180bp核酸占比在80％-90％之间；超声打断gDNA占比在50％左右；利用亚特兰提提斯双链DNA酶获得模拟血浆cfDNA占比在70％-80％之间。在本专利技术的第三方面，一种制备模拟cfDNA的方法，包括：利用亚特兰提斯双链DNA酶对所述含有基因组DNA的样本进行酶切处理，以便获得所述模拟血浆cfDNA；在本专利技术的一些实施例中，所述酶切处理的温度为37～42摄氏度。在本专利技术的一些实施例中，所述酶切处理的时间为20～60分钟。在本专利技术的第四方面，本专利技术提供了一种测序文库的构建方法，包括：根据本专利技术第一方面任一实施例所述的方法或者根据本专利技术第三方面所述的方法制备模拟cfDNA；基于所述模拟cfDNA建库，以便获得所述测序文库。本专利技术研究发现了一种亚特兰提斯双链DNA酶，能特异的切割双链DNA分子的磷酸二酯键来产生带有5’磷酸基团和3’羟基末端的短链DNA，并且可以通过适当增加酶用量和孵育时间来提高酶切效率，增加单核小体DNA得率。该方法能够为医学实验室和科研机构带来可以大量制备、性能稳定的模拟血浆cfDNA，并能减少实验室研发成本和缩短本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备模拟血浆cfDNA的方法，其特征在于，包括：/n提供培养细胞，利用消化液对所述细胞进行破碎处理，分离获得含有基因组DNA的样本；/n利用亚特兰提斯双链DNA酶对所述含有基因组DNA的样本进行酶切处理，以便获得所述模拟血浆cfDNA。/n

【技术特征摘要】
1.一种制备模拟血浆cfDNA的方法，其特征在于，包括：
提供培养细胞，利用消化液对所述细胞进行破碎处理，分离获得含有基因组DNA的样本；
利用亚特兰提斯双链DNA酶对所述含有基因组DNA的样本进行酶切处理，以便获得所述模拟血浆cfDNA。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶切处理的温度为37～42摄氏度，优选为42摄氏度。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，每106个细胞需要亚特兰提斯双链DNA酶的用量为1U以上；
任选地，所述酶切处理的时间为20～60分钟。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述模拟血浆cfDNA中大小在80～220bp的核酸占比在70％以上。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞为携带基因突变的细胞株或野生型细胞株。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，进一步包括：
将通过携带基因突变的细...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛瑞芳，王量，闫慧慧，
申请(专利权)人：杭州瑞普基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33