一株灵菌红素产生菌及其生产方法与应用技术

本发明专利技术公开了一株灵菌红素产生菌及其生产方法与应用，该灵菌红素产生菌为粘质沙雷氏菌Serratia marcescens BWL1001，保藏编号：CGMCC No.18953，生产灵菌红素的方法包括：种子液的制备；将种子液按1％(v/v)的比例转接到以大豆油作为碳源的发酵培养基中，28℃恒温摇床培养24‑48小时获得发酵液；将发酵液离心，收集上层油相，向油相中加入1～3倍体积pH＝3的酸性甲醇，振荡混匀，静置30min后，离心，收集酸性甲醇相，去除溶剂后得到灵菌红素产品，该灵菌红素对铜绿微囊藻的生长表现出良好的抑制效果。本发明专利技术所用的菌株生长速度快，发酵周期短，灵菌红素产量高、生产成本低，对于促进灵菌红素的产业化应用具有重要的推动作用。

【技术实现步骤摘要】
一株灵菌红素产生菌及其生产方法与应用
本专利技术涉及微生物发酵
，具体涉及一株灵菌红素产生菌及其生产方法与应用。
技术介绍
灵菌红素（Prodigiosin）是一种含有三吡咯环结构的天然红色素，具有多种生物活性：它能够选择性地有效抑制多种癌细胞的生长，而对正常细胞的毒性较弱；灵菌红素可以有效抑制器官移植引起的排异反应，可用于治疗自身免疫疾病；灵菌红素及其衍生物对疟原虫和锥虫具有较强的杀灭效果；具有广谱的杀菌作用，能够有效杀灭多种有害细菌和真菌；灵菌红素具有高效的抑藻活性，能杀死引起赤潮和水华的浮游藻类，在水体污染治理上表现出巨大的潜力；此外灵菌红素还可以作为天然染料，用于纺织品和日用品的染色，因此灵菌红素有较高的经济价值和良好的应用前景。灵菌红素可以通过化学合成和微生物发酵的方法进行生产。化学合成法具有反应步骤多，控制难度大，产率低等缺点，因此不利于大规模生产。而微生物发酵法生产灵菌红素具有条件温和，环境友好和易于大规模工业化生产等优点，因此近年来在国内外研究中受到越来越多的重视。灵菌红素可以由沙雷氏菌属、河氏菌属、假单胞菌属、弧菌属和链霉菌属等多种微生物产生，其中沙雷氏菌属的灵杆菌（Serratiamarcescens）因其产生灵菌红素产量相对较高，生物活性较好而成为目前用于生产的主要菌株。从自然环境中分离获得的原始菌株灵菌红素产量普遍不高，且灵菌红素在产生后大部分与产生菌的菌体相结合，少部分分泌到培养基中，因此提取和纯化较为困难。较低的产量和复杂的提取工艺导致灵菌红素价格昂贵，难于实际应用。因此降低灵菌红素的生产成本成为了限制灵菌红素大规模生产和应用的瓶颈问题。目前科研人员主要通过选育高产菌株、改进培养基配方、优化发酵工艺参数和改善提取工艺等手段来提高灵菌红素的产量和质量。例如，El-Bialy等人通过使用EMS诱变灵菌红素生产菌株，液体发酵分析发现灵菌红素产量由88.4mg/L提升至658.0mg/L，提升了6.44倍(AnnalsofMicrobiology,2015,65(1):59-68)；Giri等人使用花生粉培养基替代营养肉汤培养基，将灵菌红素产量由0.52g/L提升至39g/L(BMCMicrobiology,2004,4:11-18)；deAraujo等人改良了SerratiamarcescensUCP1549的培养基，通过添加6%的木薯废水和2%甘露醇，使得灵菌红素产量达到49.5g/L(Molecules,2010,15:6931-6940)；Liang等人将发酵容器由普通锥形瓶更换为带有挡板的锥形瓶，将SerratiamarcescensTKU011的灵菌红素产量由0.84g/L提升至2.48g/L(JournalofFoodScience,2013,78(11):1743-1751)。Chen等人通过将SerratiamarcescensC3包埋在海藻酸钙凝胶小球中进行固定化发酵，将灵菌红素产量提高至15.6g/L(BiochemicalEngineeringJournal,2013,78:93-100)。然而目前的已经报道的生产方法均难以解决灵菌红素提取困难的问题。传统方法提取灵菌红素时，需使用有机溶剂，如丙酮、氯仿、甲醇等抽提培养基，再通过减压蒸馏以获得灵菌红素产品。以上步骤需耗费的有机溶剂量大，操作复杂，能耗较高。有机溶剂的使用不仅会污染环境，而且还会杀死菌体，使得灵菌红素的连续发酵难以实现，降低了灵菌红素的发酵生产效率。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一株灵菌红素产生菌。本专利技术的目的之二是提供利用上述灵菌红素产生菌原位萃取发酵生产灵菌红素的方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一株灵菌红素产生菌，为粘质沙雷氏菌SerratiamarcescensBWL1001，该菌株分离自江苏省徐州市铜山区的农田土壤样品，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年11月18日，保藏编号：CGMCCNo.18953，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。所述的粘质沙雷氏菌SerratiamarcescensBWL1001的16SrRNA碱基序列长度为1383bp，如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供利用上述灵菌红素产生菌原位萃取发酵生产灵菌红素的方法，具体步骤如下：步骤1、将菌种SerratiamarcescensBWL1001接种于种子液培养基中，置于28℃恒温摇床内，200rpm，恒温培养12-16小时获得种子液；步骤2、将步骤1中获得的种子液按体积比1%的比例转接到以大豆油作为碳源的发酵培养基中，置于28℃恒温摇床内，200rpm，恒温培养24-48小时获得发酵液；步骤3、将步骤2中获得的发酵液在6000-10000rpm转速下离心5min，收集上层油相，向获得的油相中加入1~3倍体积pH=3的酸性甲醇，振荡混匀，静置30min后，在6000-10000rpm转速下离心5min，收集酸性甲醇相，去除溶剂后得到灵菌红素粗品；步骤4、再向下层发酵液水相中补加一定比例的新鲜发酵培养基和大豆油，实现后续的连续发酵。进一步的，步骤1中所述的种子液培养基为酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L。进一步的，步骤2中所述的发酵培养基为蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，七水硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，大豆油10%w/v。本专利技术的目的之三是提供上述生产得到的灵菌红素在制备抑藻剂方面的应用。实验表明，将灵菌红素加入含有藻类的水体中，能够抑制藻类的生长，尤其是对铜绿微囊藻的抑制效果明显。因此，灵菌红素可以用来制备抑藻剂。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：1.本专利技术所用的菌株SerratiamarcescensBWL1001生长速度快，发酵周期短，灵菌红素产量高；2.本专利技术所用的粘质沙雷氏菌可以利用廉价的大豆油作为发酵碳源，有利于提高灵菌红素的产量，降低发酵生产成本，同时大豆油与发酵液水互不相溶，多余的大豆油还可以作为灵菌红素的萃取相，将发酵产生的灵菌红素及时从发酵液水相转移至大豆油相，从而解除了反馈抑制，提高了灵菌红素的发酵产量；该原位萃取发酵方法只需要收集含有灵菌红素的油相，用于提取灵菌红素，可以减少发酵培养基成分对灵菌红素产物的影响，提高灵菌红素产品的纯度；灵菌红素提取过程中只需要回收油相，没有影响菌体的生长，因此可以通过后续向原培养基中补加一定比例的新鲜培养基和大豆油来连续发酵，有利于进一步提高灵菌红素的产量，降低产灵菌红素的生产成本；3.本专利技术生产的灵菌红素对铜绿微囊藻的生长表现出良好的抑制效果，该灵菌红素产物可以用于防控水体微藻引起的富营养化。附图说明图1是基于16SrRNA基因序列构建的菌株BWL1001系统发育树；图2是菌株BWL1001的菌落图；图3是对提取的发酵产物的质谱分析图；图4是灵菌红素产品对铜绿微囊藻本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株灵菌红素产生菌，其特征在于：该菌为粘质沙雷氏菌Serratia marcescensBWL1001，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年11月18日，保藏编号：CGMCC No.18953，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。/n

【技术特征摘要】
1.一株灵菌红素产生菌，其特征在于：该菌为粘质沙雷氏菌SerratiamarcescensBWL1001，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年11月18日，保藏编号：CGMCCNo.18953，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。


2.一种利用权利要求1所述的灵菌红素产生菌生产灵菌红素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、将菌种SerratiamarcescensBWL1001接种于种子液培养基中，置于28℃恒温摇床内，200rpm，恒温培养12-16小时获得种子液；
步骤2、将步骤1中获得的种子液按体积比1％的比例转接到以大豆油作为碳源的发酵培养基中，置于28℃恒温摇床内，200rpm，恒温培养24-48小时获得发酵液；
步骤3、将步骤2中获得的发酵液在6000-10000rpm转速下离心5min，收集上层油相，向获得的油相中加入1～3倍体积pH＝3的酸性甲醇，振荡混匀，静置30min后，在6000-10...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘伟杰，孙地，刘聪，田雁宁，杨静，朱静榕，蒋虹，
申请(专利权)人：江苏师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32