一种用于检测耐药金黄色葡萄球菌定植的方法及其试剂技术

本发明专利技术提供了一种用于检测耐药金黄色葡萄球菌定植的方法及其试剂，所述用于检测耐药金黄色葡萄球菌定植的方法包括以下步骤：将甘露醇高盐琼脂溶解于蒸馏水中，并进行灭菌，冷却至 45‑50℃时，加入抗生素利奈唑胺、万古霉素或替加环素，得到含有抗生素的甘露醇高盐琼脂溶液；将含有抗生素的甘露醇高盐琼脂溶液分别倒入无菌平皿中，调整pH值，得到检测各抗生素耐药金黄色葡萄球菌定植检测平皿；取粪便标本或体液标本，涂于检测平皿平板上，培养2天后计数各平板各抗生素耐药金黄色葡萄球菌总菌落数。本发明专利技术的技术方案操作简单，灵敏性高，可以快速筛选出利奈唑胺、万古霉素或替加环素耐药金黄色葡萄球菌，为细菌耐药防控提供基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医学检验
，尤其涉及一种用于检测耐药金黄色葡萄球菌定植的方法及其试剂。
技术介绍
金黄色葡萄球菌是临床分离的重要致病菌和定植菌之一，其中根据耐药性将其分为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。近年该类细菌临床耐药发展迅速，尤其以MRSA耐药趋势更为严重，美国每年MRSA感染导致死患者数相当于AIDS、结核病和病毒性肝炎总和，我国MRSA感染率和MRSA分离率及多重耐菌均有增加趋势。2008-2015年Mohnarin资料显示，综合医院MRSA分离株占金黄色葡萄球菌67.6％、ICU中高达84.8％。金黄色葡萄球菌居肺部感染G+球菌第一位，其中MRSA分离率26.3％；我国MRSA分离株对庆大霉素、克林霉素、大环内酯类和左氧氟沙星等抗菌药物耐药率基本上都在80％左右，对复方磺胺和利福平的耐药率低于50％。利奈唑胺(Linezoid，LZD)、糖肽类抗生素(万古霉素和替考拉宁)和替加环素是金黄色葡萄球菌治疗的“最后防线”和“王牌抗生素”，近年利奈唑胺耐药或中介分离金黄色葡萄球菌株报道逐渐增多，对替考拉宁和万古霉素中介或耐药菌株亦有报道，替加环素不敏感金黄色葡萄球菌亦逐渐引起临床关注，因此加强这些“王牌”抗生素耐药菌管理，筛查多重耐药金黄色葡萄球菌定植患者成为院内感染控制的首要任务。随着近年LZD(Linezoid，利奈唑胺)广泛应用于难治性G+(gram-positive)菌感染及结核杆菌感染，其临床耐药问题日益突出，国内外LZD耐药株散发报道日渐增多，甚至不断有院内暴发流行报道，该类耐药株主要见于肠球菌和葡萄球菌。2011-2014年CHINET数据提示LZD耐药葡萄球菌波动在0.1％-0.4％。申请人为一所三甲医院，2013年和2014年临床分离葡萄球菌LZD耐药率为0.2％和0.7％。美国LEADER研究报告近10年葡萄球菌LZD耐药数据波动在0.2-0.6％。另有散在报道提示上海、北京等多家医院均有逐渐增多的LZD耐药株散发病例。随着LZD在临床更为广泛应用，未来我们将面临其严峻的耐药形势，其中快速增加的LZD耐药葡萄球菌耐药株尤其引人关注。随着万古霉素广泛应用，临床上万古霉素治疗失败的金黄色葡萄球菌感染病例并不少见，随之提出万古霉素敏感性下降金黄色葡萄球菌和万古霉素耐药金黄色葡萄球菌(vancomycin-resistant Staphyloccus aureus，VRSA)，使临床治疗更加困难。1997年，Hiramatsu等报道了世界上首例VISA(Mu50)，其万古霉素MIC值为8μg/ml，随后不久又报道了首例分离自一位肺癌术后发生肺炎患者的痰标本菌株hVISA(Mu3)，该株万古霉素MIC值为3μg/ml，经不同浓度万古霉素平皿筛选后其MIC值可以达到8μg/ml。2002年在密西根州报道了首例于导管尖端同时培养出VRSA和万古霉素耐药的的肠球菌(vancomycin-resistant E.fecalis，VRE)患者，其分离的VRSA的MIC≥32μg/ml，目前VISA和hVISA发生耐药的机制仍处于研究阶段。随后，hVISA感染病例在世界上许多国家陆续报道。不同国家报道的hVISA感染发生率有很大不同，南韩0.71％，法国11.1％，土耳其17.97％，美国0.2％，中国13.1％。早期各项研究对hVISA和VISA检测并无统一标准，许多研究检测出hVISA和VISA并没有最后经PAP-AUC法确认，而且2006年CLSI对VISA进行新的界定，将万古霉素对hVISA的MIC由原来的8-16μg/ml修改为4-8μg/ml，所以根据新标准，hVISA和VISA发病率应该会更高。所以我们应统一hVISA和VISA的检测方法继续监测hVISA和VISA的发病率。我国目前尚无明确的VRSA报道，但对于hVISA报道较多且明确，因此万古霉素耐药金黄色葡萄球菌在我国尽管无临床耐药株报道，但关于其MIC值漂移和hVISA出现使得我们需要对该类耐药细菌进行重点监测。以往由于对万古霉素、利奈唑胺和达托霉素的高效性和低耐药认识，替加环素在G+菌感染领域的治疗作用一直作为“储备王牌”抗生素地位，近年随着万古霉素和利奈唑胺耐药G+菌逐渐增多，替加环素在G+菌(尤其是MRSA和肠球菌等)感染治疗中开始发挥越来越重要作用，其在G+菌中的耐药问题日益引起关注，替加环素耐药G+细菌报道亦逐渐增多。最近全球多中心和我国细菌药敏结果提示替加环素对多重耐药鲍曼不动杆菌耐药日益突出，MRSA、肺炎链球菌和肠球菌临床分离株替加环素耐药率保持在0.1-0.5％；但一项台湾研究表明如果按照不敏感(intermediate)标准进行统计，台湾分离的44.5％MRSA、45.9％万古霉素耐药屎肠球菌和2.8％粪肠球菌对替加环素不敏感；另有一项大样本腹部手术继发粪肠球菌腹膜炎患者研究提示尽管分离粪肠球菌未发现耐药，但18.9％对替加环素不敏感(intermediate)。综合目前的研究报道，替加环素仍是万古霉素和利奈唑胺耐药粪肠球菌和金黄色葡萄球菌治疗的重要补救选择，但其面临严峻的耐药挑战，尤其是随着其在G-菌中更为广泛应用可能会导致筛选耐药出现，目前散发报道临床分离替加环素耐药粪肠球菌和金黄色葡萄球菌病例日渐增多即是这一趋势的最好“写照”。因此随着替加环素在临床更为广泛的应用，未来我们将面临其严峻的耐药形势，其中金黄色葡萄球菌和肠球菌中的耐药增多尤其引人关注。随着耐药金黄色葡萄球菌报道日渐增多，临床院感工作中如何对该类多重耐药菌(multi-drug resistant organism,MDRO)进行院感耐药管理成为临床需要明确的紧迫问题，根据我国最新公布的《多重耐药菌医院感染预防与控制中国专家共识》要求和院内万古霉素耐药肠球菌(Vancomycin-resistant enterococci,VRE)监测经验，理论上对该类细菌均应采取接触隔离处理措施。然而对于这些MDRO定植患者进行接触隔离的临床意义仍在深入研究中，该类细菌包括LZD耐药和替加环素耐药细菌在院内感染防控中是否也需要“享受”VRE相同“待遇”仍有待理论支持。因此，建立方便快捷的检测和监测多重耐药金黄色葡萄球菌定植用于该类临床研究和常规院感检测非常有必要，但是如何将这些MDRO快速简单从患者标本中分离定植的耐药株并能定量，如何动态从体内监测多重耐药金黄色葡萄球菌株定植变化，目前鲜见相关研究。常用的方法为通过血平板监测大便标本中的菌群生长情况，根据细菌形态学特点挑取其中葡萄球菌株，然后进行鉴定最后确定该菌株是否为利奈唑胺或万古霉素或替加环素耐药葡萄球菌，但是这一过程操作复杂、阳性率低，不能有效筛选耐药株定植的阳性人群。
技术实现思路
针对以上技术问题，本专利技术公开了一种用于检测耐药金黄色葡萄球菌定植的方法及其试剂，操作简单，阳性率高，可以迅速准确筛选出多重耐药金黄色葡萄球菌定植人群有利于临床中耐药传播的控制和抗生素选择，从而为细菌耐药防控提供基础。对此，本专利技术采用的技术方案为：一种用于检测耐药金黄色葡萄球菌定植的方法，包括以下步骤：步骤S1：将甘露醇高盐琼脂溶解于蒸馏水中，并进行灭菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测耐药金黄色葡萄球菌定植的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤S1：将甘露醇高盐琼脂溶解于蒸馏水中，并进行灭菌，冷却至 45‑50℃时，加入利奈唑胺、万古霉素或替加环素，得到含有利奈唑胺、万古霉素或替加环素的甘露醇高盐琼脂溶液，然后将所述含有利奈唑胺、万古霉素或替加环素的甘露醇高盐琼脂溶液倒入无菌平皿中，调整pH值，得到利奈唑胺、利奈唑胺、万古霉素或替加环素的耐药金黄色葡萄球菌定植检测平皿；其中，所述含有利奈唑胺的甘露醇高盐琼脂溶液中，所述利奈唑胺的浓度为2~3ug/ml，所述利奈唑胺的耐药金黄色葡萄球菌定植检测平皿的pH值为7.3‑7.6；所述含有万古霉素的甘露醇高盐琼脂溶液中，所述万古霉素的浓度为2.5~3.5ug/ml，所述万古霉素的耐药金黄色葡萄球菌定植检测平皿的pH值为7.2‑7.4；所述含有替加环素的甘露醇高盐琼脂溶液中，所述替加环素的浓度为0.2‑0.5ug/ml，所述替加环素的耐药金黄色葡萄球菌定植检测平皿的pH值为7.3‑7.4；步骤S2：取粪便标本或体液标本，涂于步骤S1中所述利奈唑胺、利奈唑胺、万古霉素或替加环素的耐药金黄色葡萄球菌定植检测平皿的平板上，并同时涂于无抗平皿中作为对照，培养2天后计数无抗平皿中的总菌落数和各抗生素平皿中的耐药金黄色葡萄球菌的总菌落数。...

【技术特征摘要】
1.一种用于检测耐药金黄色葡萄球菌定植的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤S1：将甘露醇高盐琼脂溶解于蒸馏水中，并进行灭菌，冷却至 45-50℃时，加入利奈唑胺、万古霉素或替加环素，得到含有利奈唑胺、万古霉素或替加环素的甘露醇高盐琼脂溶液，然后将所述含有利奈唑胺、万古霉素或替加环素的甘露醇高盐琼脂溶液倒入无菌平皿中，调整pH值，得到利奈唑胺、利奈唑胺、万古霉素或替加环素的耐药金黄色葡萄球菌定植检测平皿；其中，所述含有利奈唑胺的甘露醇高盐琼脂溶液中，所述利奈唑胺的浓度为2~3ug/ml，所述利奈唑胺的耐药金黄色葡萄球菌定植检测平皿的pH值为7.3-7.6；所述含有万古霉素的甘露醇高盐琼脂溶液中，所述万古霉素的浓度为2.5~3.5ug/ml，所述万古霉素的耐药金黄色葡萄球菌定植检测平皿的pH值为7.2-7.4；所述含有替加环素的甘露醇高盐琼脂溶液中，所述替加环素的浓度为0.2-0.5ug/ml，所述替加环素的耐药金黄色葡萄球菌定植检测平皿的pH值为7.3-7.4；步骤S2：取粪便标本或体液标本，涂于步骤S1中所述利奈唑胺、利奈唑胺、万古霉素或替加环素的耐药金黄色葡萄球菌定植检测平皿的平板上，并同时涂于无抗平皿中作为对照，培养2天后计数无抗平皿中的总菌落数和各抗生素平皿中的耐药金黄色葡萄球菌的总菌落数。2.根据权利要求1所述的用于检测耐药金黄色葡萄球菌定植的方法，其特征在于：步骤S1中，所述含有利奈唑胺的甘露醇高盐琼脂溶液中，所述利奈唑胺的浓度为2.5ug/ml；所述含有万古霉素的甘露醇高盐琼脂溶液中，所述万古霉素的浓度为3ug/ml；所述含有替加环素的甘露醇高盐琼脂溶液中，所述替加环素的浓度为0.3ug/ml。3.根据权利要求1所述的用于检测耐药金黄色葡萄球菌定植的方法，其特征在于：步骤S1中，所述利奈唑胺的耐药金黄色葡萄球菌定植检测平皿的pH值为7.3；所述万古霉素的耐药金黄色葡萄球菌定植检测平皿的pH值为7.2；所述替加环素的耐药金黄色葡萄球菌定植检测平皿的pH值为7.3。4.根据权利要求1所述的用于检测耐药金黄色葡萄球菌定植的方法，其特征在于：还包括步骤S3：从步骤S2的平板上随机挑取金黄色葡萄球菌克隆，进行革兰染色＋凝集酶检测，然后采用E-test方法测定菌株各抗生素MIC值；其中，所述耐药菌株在确定其MIC值之前，应在无抗生素培...

【专利技术属性】
技术研发人员：余治健，邓启文，程航，郑金鑫，陈重，
申请(专利权)人：深圳市南山区人民医院，
类型：发明
国别省市：广东;44