一株天然耐铵固氮类芽孢杆菌AH-4及其应用制造技术

本发明专利技术涉及固氮微生物技术领域，具体涉及一株天然耐铵固氮类芽孢杆菌AH‑4及其应用。本发明专利技术提供一株类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)AH‑4，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18766。该菌含有固氮酶结构基因nifH，在高浓度铵(50‑300mM)条件下能够保持很高的固氮活性，打破了高铵条件对生物固氮的抑制作用，可在农业生产中推广使用，有效减少化肥的使用量。

A natural ammonium resistant and nitrogen fixing Bacillus ah-4 and its application

【技术实现步骤摘要】
一株天然耐铵固氮类芽孢杆菌AH-4及其应用
本专利技术涉及固氮微生物
，具体涉及一株天然耐铵固氮类芽孢杆菌AH-4及其应用。
技术介绍
氮素是植物生长必需的大量元素。地球表面的氮素含量丰富,但大多数以惰性氮气的形式存在于大气中,不能被生物体所利用。为了保障粮食作物及蔬菜瓜果的高产，多需大量使用化学氮肥。但长期过量施用化学氮肥，会导致土壤恶化、环境污染和产品品质下降，阻碍农业经济的可持续发展。生物固氮是指少数原核微生物在体内固氮酶作用下，将空气中的氮气还原成铵的过程。但生物固氮的效率受环境中铵的影响，高浓度的铵抑制固氮作用。换言之，在贫瘠的土壤里，固氮微生物能充分发挥固氮作用，而在肥沃的土壤里，固氮微生物则只生长而不固氮。通常，固氮微生物只有在氨同化机制被化学或遗传改造修饰的情况下,才能在过量铵存在下表达固氮酶。几乎所有的天然固氮菌只能够在低铵条件下进行固氮。目前报道的固氮微生物在高浓度铵条件下的固氮活性均较低。获得在高浓度铵条件下能够高效固氮的微生物，使固氮微生物在贫瘠和肥沃的土壤里都能充分发挥固氮作用，对在农业生产中减少化肥的用量，具有重要的应用价值。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术的目的在于提供一株天然耐铵固氮类芽孢杆菌AH-4及其应用。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供一株耐铵固氮类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)AH-4，该菌株是从自然环境中分离得到，并于2019年10月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为类芽孢杆菌Paenibacillussp.，保藏编号为CGMCCNo.18766。本专利技术提供的类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)AH-4在LD固体培养基上菌落为圆形，湿润，白色，具有完整的边缘。本专利技术提供的类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)AH-4含有结构基因为nifH，编码该基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术提供的类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)AH-4的16SrDNA基因序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供包含所述耐铵固氮类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)AH-4的菌剂。本专利技术中，所述包含耐铵固氮类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)AH-4的菌剂可以为液体菌剂或固体菌剂。所述包含耐铵固氮类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)AH-4的菌剂可以采用常规技术手段、加入微生物制剂领域允许的辅料制备得到。本专利技术的类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)AH-4的固氮酶活性明显高于本领域公认的类芽孢杆菌(Paenibacillus)属内固氮酶活性最高的菌株PaenibacillusdurusATCC35681，因此具有更高的应用潜力。本专利技术通过实验证实，类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)AH-4能够耐受50～300mM的高浓度铵，在所处环境中NH4+的浓度达到50～300mM时仍能够保持较高的固氮酶活性、进行高效的生物固氮。本专利技术提供所述类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)AH-4或包含所述类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)AH-4的菌剂在生物固氮中的应用。作为本专利技术的一种实施方式，所述生物固氮为在铵离子浓度为0～5mM的低铵浓度条件下的生物固氮。优选为铵离子浓度为0～4mM条件下的生物固氮。更优选为铵离子浓度为0～1mM条件下的生物固氮。作为本专利技术的另一种实施方式，所述生物固氮为在铵离子浓度大于20mM的高铵浓度条件下的生物固氮。上述铵离子浓度大于20mM的高铵浓度条件的铵离子浓度可为30～450mM。优选为50～400mM。更优选为50～300mM。本专利技术提供所述类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)AH-4或包含所述类芽孢杆菌AH-4的菌剂在肥料制备中的应用。本专利技术提供一种生物肥料，其包含所述类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)AH-4或包含所述类芽孢杆菌AH-4的菌剂。本专利技术提供所述类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)AH-4或包含所述类芽孢杆菌AH-4的菌剂或所述生物肥料在植物种植中的应用。本专利技术提供所述类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)AH-4或包含所述类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)AH-4的菌剂在选育固氮微生物中的应用。上述在选育固氮微生物中的应用可为利用类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)AH-4通过诱变、基因工程改造等育种方法进行固氮微生物的选育。本专利技术提供所述类芽孢杆菌AH-4或包含所述类芽孢杆菌AH-4的菌剂或所述生物肥料在促进植物生长或提高植物产量中的应用。优选地，上述应用为将类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)AH-4施用于所述植物。本专利技术还提供一种促进植物生长或提高植物产量的方法，其为：通过对所述植物施用所述类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)AH-4或包含所述类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)AH-4的菌剂促进植物生长或提高植物产量。优选地，所述类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)AH-4的施用可为采用所述类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)AH-4的菌悬液浸泡种子或采用所述类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)AH-4的菌悬液浇灌所述植物；或者将化肥与类芽孢杆菌AH-4的菌悬液联合施用于所述植物。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了一株天然耐铵固氮类芽孢杆菌AH-4，该菌株在高浓度铵条件下能够保持较高的固氮活性、进行高效的生物固氮(该菌株在无铵条件下的固氮酶活性为7689.2nmolC2H4/mgproteinh，在100mM高铵条件下的固氮酶活性为4124.59nmolC2H4/mgproteinh，而现有技术中的天然固氮菌一般只能够在0～5mMNH4+范围内才具有固氮酶活性)，打破了高铵条件对生物固氮的抑制作用，使固氮微生物在贫瘠和肥沃的土壤里都能充分发挥固氮作用，在农业生产中具有广泛的应用前景。附图说明图1为本专利技术实施例1菌株类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)AH-4在无氮平板上的菌落形态。图2为本专利技术实施例1中菌株类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)AH-4的nifH和16SrDNA的扩增产物的电泳图；图3为本专利技术实施例2中菌株类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)AH-4在不同铵浓度条件下的固氮酶活性。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本专利技术的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株耐铵固氮类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)AH-4，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18766。/n

【技术特征摘要】
1.一株耐铵固氮类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)AH-4，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.18766。


2.包含权利要求1所述的类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)AH-4的菌剂。


3.权利要求1所述的类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)AH-4或权利要求2所述的菌剂在生物固氮中的应用。


4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述生物固氮为在铵离子浓度为0～5mM的低铵浓度条件下的生物固氮。


5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述生物固氮为在铵离子浓度大于20mM的高铵浓度条件下的生物固氮。


6....

【专利技术属性】
技术研发人员：陈三凤，李琴，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11