白色念珠菌荧光免疫层析测定试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种白色念珠菌荧光免疫层析测定试剂盒及其制备方法，包括检测卡、SD卡和样品稀释液；所述检测卡由一壳体和免疫层析试纸条组成，所述免疫层析试纸条位于壳体内部，包括底板，所述底板上沿其长度方向顺次设置有一样品垫、一结合垫、硝酸纤维素膜和一吸样垫，所述结合垫上固定有荧光微球标记的抗白色念珠菌单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上设置有检测T线和质控C线，所述T线上包被有与所述荧光微球标记的单克隆抗体配对的单克隆抗体，所述C线上包被有与所述荧光微球标记的单克隆抗体配对的二抗。本发公开的试剂盒检测灵敏度、准确度、精密度均更高，对于动态监测患者病情、预后评估及检测复发、指导临床医生及时作出重要的医学决策均有重要意义。

Fluorescent immunochromatography kit for Candida albicans and its preparation

【技术实现步骤摘要】
白色念珠菌荧光免疫层析测定试剂盒及其制备方法
本专利技术属于微生物免疫检测
，更具体地说，涉及一种白色念珠菌荧光免疫层析测定试剂盒。
技术介绍
白色念珠菌是一类腐败物寄生菌，单细胞真菌，是阴道内的正常菌群且生存于健康人的皮肤、黏膜，正常情况下白色念珠菌与机体处于共生状态，不致炎症。但当某种因素破坏其平衡状态，则局部白色念珠菌由酵母菌相转为菌丝相，在局部大量生长繁殖，引起皮肤、黏膜甚至全身念珠菌病，故又称之为条件性致病菌。念珠菌性外阴阴道炎(VVC)是最常见的妇女外阴阴道炎之一，且易复发，其中，白色念珠菌阴道炎占80～90％，常见于青春期至绝经期前。75％妇女一生中至少患一次VVC。由于念珠菌性阴道炎具有难以根治、易反复的特点，对孕妇的危害更大，可增加胎膜早破、羊水污染、早产以及产时、产后感染等并发症，引发早产、胎儿感染、畸形，威胁母婴健康，因此及时准确地诊断和鉴别念珠菌性阴道炎，采取有效的治疗措施，对于提高国民的健康水平，特别是女性生殖健康水平，具有重要的现实和深远意义。实验室检查念珠菌的方法有：涂片显微镜镜检(湿片法)；培养法；抗原检测法，如乳胶凝集法、免疫层析法、免疫荧光法；核酸检测法，如PCR。湿片法是临床常规检测方法，培养法是检查念珠菌最为灵敏和特异的方法，但因操作麻烦，耗时长通常不作为常规检测，直接免疫荧光染色及核酸检测方法需相应仪器设备及对操作人员的技术要求而限制其使用。目前，已有公司开发出检测白色念珠菌的试剂盒，但均为定性检测，且所用样本稀释液无法使检测目标物良好的分散开来，导致检测误差大、重复性差。中国专利CN107132353A公开了一种B族链球菌的检测试剂盒及其制备方法，虽然也能给出定量检测结果，但是其采用ABS系统，制备工艺复杂，且需要两株抗体分别标记，有两个结合垫，两个样本处理液，使用时需要按比例混合，系统误差大，不利于CV的控制。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种检测误差小，准确度高的白色念珠菌荧光免疫层析测定试剂盒。本专利技术的第二个目的在于，提供一种检测误差小，准确度高的白色念珠菌荧光免疫层析测定试剂盒的制备方法。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种白色念珠菌荧光免疫层析测定试剂盒，其特征在于，包括检测卡、SD卡和样品稀释液；所述检测卡，由一壳体和免疫层析试纸条组成，所述免疫层析试纸条位于壳体内部，包括底板，所述底板上沿其长度方向顺次设置有一样品垫、一结合垫、硝酸纤维素膜和一吸样垫，所述结合垫上固定有荧光微球标记的抗白色念珠菌单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上设置有检测T线和质控C线，所述T线上包被有与所述荧光微球标记的单克隆抗体配对的单克隆抗体，所述C线上包被有与所述荧光微球标记的单克隆抗体配对的二抗；所述SD卡内存储有标准曲线，采用平板计数法与光密度法关系曲线建立定标方式，使用定标浓度与仪器信号值关系曲线建立标准曲线，实现定量检测；所述样品稀释液包括磷酸盐缓冲液和玻璃珠。作为一个优选方案，所述结合垫制备时白色念珠菌单克隆抗体与荧光微球质量比为0.3～0.7:10。作为一个优选方案，所述结合垫设置封闭1和封闭2，所述封闭1为加入甘氨酸和乙醇胺封闭；所述封闭2为加入BSA和兔IgG封闭，所述BSA与荧光微球质量比为4～2:1，所述兔IgG与荧光微球质量比为0.5～2:1。作为一个优选方案，所述样品稀释液还包括亲水性表面活性剂，所述亲水性表面活性剂优选为吐温20或曲拉通100。作为一个优选方案，所述样品稀释液以1000重量份计，包括吐温20或曲拉通1001～5份，玻璃珠1～5份和余量的磷酸盐缓冲液。为了实现上述第二个目的，本专利技术提供了一种白色念珠菌荧光免疫层析测定试剂盒的制备方法，所述试剂盒包括检测卡、SD卡和样品稀释液，所述检测卡的制备方法为，将吸样垫、结合垫、样品垫依次固定在包被抗白色念珠菌单克隆抗体的硝酸纤维素膜底板上，切割成试纸条，加干燥剂于常温下密封保存；所述结合垫通过以下方法制备：(1)缓冲液置换：取微粒加入MES缓冲液离心，去除上清，加入少量MES超声重悬，待用；(2)活化：向微球中加入NHS和EDC，混匀；(3)清洗：活化结束后，加入MES缓冲液离心，去除上清，加入少量MES超声重悬；加入HEPES缓冲液超声重悬，补满HEPES离心，加HEPES重悬后待用；(4)抗体反应：加入相应量HEPES预先透析的抗体，白色念珠菌单克隆抗体与荧光微球质量比为0.3～0.7:10，混匀后反应；(5)封闭1：加入甘氨酸和乙醇胺封闭；(6)封闭2：加入BSA和兔IgG，BSA与荧光微球质量比为2:1，兔IgG与荧光微球质量比为0.5～2:1，混匀后封闭；(7)清洗：加入PBST清洗两次，加微球保存液清洗一次后，加入适宜量的微球保存液，置于2～8℃保存备用；(8)铺结合垫：将标记好的微球偶联物稀释至合适的浓度，铺在玻璃纤维上，置于鼓风干燥箱中干燥；所述包被抗白色念珠菌单克隆抗体的硝酸纤维素膜通过以下方法制备：(1)T线划线液配制：用缓冲液将白色念珠菌单克隆抗体稀释至1.0～2.0mg/mL；(2)C线划线液配制：用缓冲液将羊抗兔IgG抗体稀释至1.5～2.0mg/mL；(3)采用喷金划膜仪，将C线抗体、T线抗体分别包被在固定于底板上的硝酸纤维素膜上；(4)将划好的大板置于鼓风干燥箱中干燥；所述SD卡通过以下方法制备：(1)白色念珠菌平板计数法与光密度法关系曲线建立：配制不同浓度梯度的白色念珠菌菌悬液并在600nm波长下分别测定OD值，将不同梯度的菌悬液样品同时做稀释涂平板培养计数，将OD600和对应菌体浓度做直线回归，得出回归方程；(2)参考品制备：将白色念珠菌接种于液体培养基中，摇床震荡培养，离心去上清，加入生理盐水洗涤，加入少量细胞冻存液重悬菌体，在600nm波长下测量OD值，根据白色念珠菌平板计数法与光密度法关系回归方程，计数出制得的参考品浓度，分装冻存备用；(3)校准品制备：用样品稀释液将参考品稀释至覆盖线性范围的几个浓度点，分装冻存备用；(4)校准品测试：取不同浓度的校准品滴加到免疫层析试纸条的加样孔，通过荧光免疫分析仪读取检测信号值；(5)校准曲线生成：根据校准品的制备浓度和荧光值采用合适的拟合方式生成该批试剂的校准曲线，并用仪器软件将曲线导入SD卡中。制备包被抗白色念珠菌单克隆抗体的硝酸纤维素膜的缓冲液常一般使用：Tris(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液，硼酸-硼砂缓冲液，优先选择0.01mol/LPBS(含10g/L蔗糖)，pH7.0～7.4。文中出现的MES是指(2-吗啉乙磺酸)缓冲液、NHS是指(N-羟基琥珀酰亚胺)、EDC是指((1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐))、HEPES是指(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲液。所述磷酸盐缓冲液为0.01～0.02mol/LPBS，pH为7.0～7.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种白色念珠菌荧光免疫层析测定试剂盒，其特征在于，包括检测卡、SD卡和样品稀释液；/n所述检测卡，由一壳体和免疫层析试纸条组成，所述免疫层析试纸条位于壳体内部，包括底板，所述底板上沿其长度方向顺次设置有一样品垫、一结合垫、硝酸纤维素膜和一吸样垫，所述结合垫上固定有荧光微球标记的抗白色念珠菌单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上设置有检测T线和质控C线，所述T线上包被有与所述荧光微球标记的单克隆抗体配对的单克隆抗体，所述C线上包被有与所述荧光微球标记的单克隆抗体配对的二抗；/n所述SD卡内存储有标准曲线，采用平板计数法与光密度法关系曲线建立定标方式，使用定标浓度与仪器信号值关系曲线建立标准曲线，实现定量检测；/n所述样品稀释液包括磷酸盐缓冲液和玻璃珠。/n

【技术特征摘要】
1.一种白色念珠菌荧光免疫层析测定试剂盒，其特征在于，包括检测卡、SD卡和样品稀释液；
所述检测卡，由一壳体和免疫层析试纸条组成，所述免疫层析试纸条位于壳体内部，包括底板，所述底板上沿其长度方向顺次设置有一样品垫、一结合垫、硝酸纤维素膜和一吸样垫，所述结合垫上固定有荧光微球标记的抗白色念珠菌单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上设置有检测T线和质控C线，所述T线上包被有与所述荧光微球标记的单克隆抗体配对的单克隆抗体，所述C线上包被有与所述荧光微球标记的单克隆抗体配对的二抗；
所述SD卡内存储有标准曲线，采用平板计数法与光密度法关系曲线建立定标方式，使用定标浓度与仪器信号值关系曲线建立标准曲线，实现定量检测；
所述样品稀释液包括磷酸盐缓冲液和玻璃珠。


2.根据权利要求1所述的一种白色念珠菌荧光免疫层析测定试剂盒，其特征在于，所述结合垫制备时白色念珠菌单克隆抗体与荧光微球质量比为0.3～0.7:10。


3.根据权利要求1所述的一种白色念珠菌荧光免疫层析测定试剂盒，其特征在于，所述结合垫设置封闭1和封闭2，所述封闭1为加入甘氨酸和乙醇胺封闭；所述封闭2为加入BSA和兔IgG封闭，所述BSA与荧光微球质量比为4～2:1，所述兔IgG与荧光微球质量比为0.5～2:1。


4.根据权利要求1所述的一种白色念珠菌荧光免疫层析测定试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液还包括亲水性表面活性剂，所述亲水性表面活性剂优选为吐温20或曲拉通100。


5.根据权利要求4所述的一种白色念珠菌荧光免疫层析测定试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液以1000重量份计，包括吐温20或曲拉通1001～5份，玻璃珠1～5份和余量的磷酸盐缓冲液。


6.权利要求1所述一种白色念珠菌荧光免疫层析测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述试剂盒包括检测卡、SD卡和样品稀释液，
所述检测卡的制备方法为，将吸样垫、结合垫、样品垫依次固定在包被抗白色念珠菌单克隆抗体的硝酸纤维素膜底板上，切割成试纸条，加干燥剂于常温下密封保存；
所述结合垫通过以下方法制备：
(1)缓冲液置换：取微粒加入MES缓冲液离心，去除上清，加入少量MES超声重悬，待用；
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【专利技术属性】
技术研发人员：董常慧，
申请(专利权)人：江苏美克医学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32