结直肠癌术后复发危险分层检测方法技术

本发明专利技术属于疾病检测技术领域，具体涉及一种结直肠癌术后复发危险分层检测方法。所述方法包括：收集结直肠癌患者的肿瘤组织，提RNA并逆转录成cDNA，以cDNA作为模板PCR扩增出组织中9个mRNA分子和内参基因GAPDH的CT值，计算各mRNA表达量EV，将9个mRNA分子的表达量EV代入危险评分公式中，计算得到患者的危险评分RS，根据危险评分RS的数值对患者复发风险进行危险分组划分。

Risk stratification for postoperative recurrence of colorectal cancer

【技术实现步骤摘要】
结直肠癌术后复发危险分层检测方法
本专利技术属于疾病检测
，具体涉及一种结直肠癌术后复发危险分层检测方法。
技术介绍
结直肠癌(CRC)是全球第三大肿瘤，约60％的CRC患者诊断时即为II/III期。尽管新诊断和治疗技术取得了显着进步，但手术切除后肿瘤复发仍然是最困难的挑战。准确预测高风险复发对于确定辅助治疗的潜在候选患者至关重要。TNM分期系统对于预测手术切除后肿瘤复发具有局限性。因此，迫切需要用于预测肿瘤复发的新型分子标记物来改善个性化治疗。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，目的在于提供一种结直肠癌术后复发危险分层检测方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案为：一种结直肠癌术后复发危险分层检测方法，包括如下步骤：(1)收集结直肠癌患者的肿瘤组织，提取肿瘤组织总RNA，逆转录成cDNA；(2)以cDNA作为模板进行PCR扩增反应，确定肿瘤组织中9个mRNA分子和内参基因(GAPDH)的CT值，然后确定每个mRNA分子的ΔCT，具体如下:ΔCT＝CTmRNA-CTGAPDH，我们根据ΔCT确定每个mRNA的相对表达量(RelativeValue,RV)，具体如下：RV＝2-ΔCT；(3)为将9个mRNA分子的表达量(ExpressionValue,EV)确定在特定的合适范围内，我们采用特定的公式根据相对表达量(RV)计算各mRNA分子的表达量(EV)作为建模变量，具体如下：EV＝log2(RV×10000+1)；(4)将9个mRNA分子的表达量(EV)代入危险评分公式中，计算患者的危险评分数值(RiskScore,RS)，根据危险评分数值对患者复发风险进行危险分组划分。上述方案中，所述9个mRNA的基因名为：KLK10、DUSP27、CXCL13、SCG2、C2orf40、MFAP4、C2CD4A、CHGA和CHGB，具体如下表1所示。表19个mRNA全名和基因编号上述方案中，所述PCR扩增反应中，用于扩增9个RNA的引物序列及内参基因GAPDH的序列如下表2所示：表2引物序列上述方案中，所述危险评分公式为：ln(RS)＝0.44216×EVC2orf40+0.13135×EVDUSP27+0.11162×EVKLK10-0.10893×EVC2CD4A+0.12615×EVSCG2-0.10634×EVCXCL13+0.0779×EVCHGA+0.09549×EVCHGB+0.08248×EVMFAP4-0.62326。上述方案中，所述根据危险评分数值对患者的复发风险进行危险分组划分的具体规则为：若危险评分大于0.9803，则将患者划分为高危组，反则将患者划分为低危组。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种基于9个mRNA的组合(KLK10、DUSP27、CXCL13、SCG2、C2orf40、MFAP4、C2CD4A、CHGA和CHGB)的危险评分公式来预测结直肠癌术后复发危险分层的检测方法；通过检测并计算9个mRNA的分子表达量，代入危险评分公式中计算患者的危险评分数值，如果所得危险评分大于0.9803，则将患者划分为高危组，反则将患者划分为低危组；在临床验证集中(109例)，低危组4年无复发生存率为93.3％，高危组4年无复发生存率仅为53.7％；在临床独立集中(100例)，低危组4年无复发生存率为89.9％，高危组4年无复发生存率为54.4％。附图说明图1.临床验证集(A)和临床独立集(B)中低危和高危组的无复发生存(Recurrence-freeSurvival)曲线。图2为芯片验证集和芯片独立集中高危组和低危组的结果。具体实施方式为了更好地理解本专利技术，下面结合实施例进一步阐明本专利技术的内容，但本专利技术的内容不仅仅局限于下面的实施例。实施例1基于芯片队列发现确定该检测方法的组成我们从GeneExpressionOmnibus数据库下载了公开的芯片数据集(GSE39582，GSE17536和GSE8671)。在芯片数据集GSE8671中，包括32对结直肠癌和相邻正常组织。在芯片训练集(GSE39582，n＝460)和芯片验证集(GSE17536，n＝111)，总共包括571名II-III期的CRC患者。首先将芯片数据集GSE8671中，对32对肿瘤和相邻正常组织的RNA表达水平进行标准化处理并进行log2转化，使用R语言的limma包进行表达差异的分析。若表达变化倍数(FoldChange,FC)大于等于10倍，且p值＜0.05时，作为差异基因的选择标准，共确定88个表达差异基因。随后，我们在临床训练集(n＝460，GSE39582)中，将这88个表达差异基因进行单因素cox回归分析，将差异表达的RNA分子进行单变量cox回归分析，即比较RNA分子表达的高低对结直肠癌患者的生存状况RFS(无复发生存)或OS(总生存)的影响有无统计学差异意义，共发现9个mRNA(KLK10，DUSP27，CXCL13，SCG2，C2orf40，MFAP4，C2CD4A，CHGA和CHGB)可作为建立预后分层模型的候选基因(p＜0.05)，其各个RNA分子在单因素COX回归分析中的HR危险比及95％CI置信区间如表3所示。表3ThecharacteristicsofninedifferentiallyexpressedRNAsassociatedwithrecurrence-freesurvivalinthemicroarraytrainingset(n＝460，GSE39582)Abbreviations:CI＝confidenceindex,HR＝hazardratio,mRNA＝messengerribonucleicacids.利用芯片训练集(n＝460，GSE39582)和芯片独立集(n＝111，GSE17536)进行COX回归模型建模，得到每个候选的RNA分子的回归系数，我们根据每个候选的RNA分子的表达量和其回归系数，计算每个患者的预后指数(PrognosticIndex,PI)。然后根据每个患者的预后指数(PI)-数据集中预后指数的平均值，计算每个患有CRC的患者的风险评分，具体如下：ln(RS)＝PI-mean(PI)其中，n代表候选RNA分子的数量，Ci代表第i个候选RNA分子的在COX回归模型中的系数，EVi代表第i个候选RNA分子的表达量，mean(PI)代表数据集中预后指数的平均值。根据此预后分层模型，为芯片训练集(GSE39582,n＝460)和芯片验证集(GSE17536,n＝111)中每个患者计算危险评分，我们发现随着风险评分的增加，肿瘤复发的发生率也在增加。研究中采用Yonden指数法确定危险评分的最佳截断值，根据危险评分的最佳截断值(1.1673)，将CRC患者分为高危组和低危组，并通过Kaplan-Meier本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种结直肠癌术后复发危险分层检测方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)收集结直肠癌患者的肿瘤组织，提取肿瘤组织总RNA，逆转录成cDNA；/n(2)以cDNA作为模板进行PCR扩增反应，确定肿瘤组织中9个mRNA分子和内参基因GAPDH的CT值，然后确定每个mRNA分子的ΔCT，我们根据ΔCT确定每个mRNA的相对表达量RV，所述ΔCT＝CT

【技术特征摘要】
1.一种结直肠癌术后复发危险分层检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)收集结直肠癌患者的肿瘤组织，提取肿瘤组织总RNA，逆转录成cDNA；
(2)以cDNA作为模板进行PCR扩增反应，确定肿瘤组织中9个mRNA分子和内参基因GAPDH的CT值，然后确定每个mRNA分子的ΔCT，我们根据ΔCT确定每个mRNA的相对表达量RV，所述ΔCT＝CTmRNA-CTGAPDH，所述RV＝2-ΔCT；
(3)为将9个mRNA分子的表达量EV确定在特定的合适范围内，我们采用特定的公式根据相对表达量RV计算每个mRNA分子的表达量EV作为建模变量，具体如下：EV＝log2(RV×10000+1)；
(4)将9个mRNA分子的表达量EV代入危险评分公式中，计算得到患者的危险评分RS，根据危险评分RS的数值对患者复发风险进行危险分组划分。


2.根据权利要求1所述结直肠癌术后复发危险分层检测方法，其特征在于，所述9个mRNA的基因名为：KLK10、DUSP27、CXCL13、SCG2、C...

【专利技术属性】
技术研发人员：周福祥，徐国增，孙雪花，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42