本发明专利技术公开了一种实时荧光定量PCR检测PD‑L1基因表达量的方法、引物及试剂盒，所述方法，包括如下步骤：(1)同步抽提样本中的DNA及mRNA；(2)以待测mRNA为模板，通过特殊的反转录引物合成第一链cDNA；(3)分别采用反转录引物上的特异序列所对应的引物及参照基因对应的特异性引物，以反转录产物cDNA及参照基因DNA为模板，进行双通道实时荧光定量PCR扩增，同时扩增目的基因cDNA与参照基因，并以参照基因和目的基因序列连接构建的质粒为标准品，根据各自的标准曲线，计算样本中目的基因与参照基因拷贝数比值，即得目的基因的表达水平，本发明专利技术同步修正各种实验操作误差，保证了结果的可靠性和可重复性。
Detection of PD-L1 gene expression by real-time fluorescence quantitative PCR: method, primer and kit
【技术实现步骤摘要】
实时荧光定量PCR检测PD-L1基因表达量的方法、引物及试剂盒
本专利技术涉及对PD-L1基因表达量进行检测的方法。
技术介绍
程序性细胞死亡因子配体1(processeddeath-1ligand1，PD-L1)又称为B7-H1、CD274，是由CD274基因编码的一个抑制性共刺激分子。PD-L1属I型跨膜糖蛋白，有290个氨基酸，包括胞外区、疏水跨膜区和尾部胞浆区。PD-L1蛋白则广泛表达于淋巴细胞，如活化T和B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、胸腺内皮细胞等细胞以及心脏和胎盘等部位，同时也在多种肿瘤细胞及肿瘤微环境中的免疫细胞中高表达，如肺癌、食管癌、乳腺癌、淋巴瘤等，所述的PD-L1在文献：Dong,H.etal.(2002)NatMed8,793-800、hompson,R.H.etal.(2006)CancerRes66,3381-5.和Pardoll,D.M.(2012)NatRevCancer12,252-64.中有详细的报道。肿瘤细胞免疫逃逸是肿瘤躲避免疫系统清除的重要原因之一。表达于肿瘤细胞表面的PD-L1与PD-1结合抑制T细胞的激活，使其不能发现肿瘤。抗PD-L1单抗能有效结合肿瘤细胞表面的PD-L1，阻断信号通路，激活T细胞，并杀死肿瘤细胞。阻断PD-L1/PD-1通路能提高T细胞的反应。研究发现，PD-L1在非肌层浸润性膀胱癌细胞表达水平与肿瘤病理分期相关，根据PD-L1的表达选择药物，可以提高治疗效果。下调肺腺癌A549细胞PD-L1的mRNA表达，可以增强杀伤细胞对A549细胞的杀伤作用。PD-L1蛋白是非小细胞肺癌中预测肿瘤术后进展的重要指标。PD-L1的预后指标作用在其他肿瘤的研究中也有相关报道。大量的研究表明，PD-L1可以作为一种重要的分子标志物在各种肿瘤中的靶向治疗和预后诊断中发挥着重要的作用。抗体药物是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的药物，具有特异性高、机制明确、疗效显著、毒副作用少等优点，在各种疾病治疗、特别是对肿瘤治疗有非常广阔的前景。目前美国FDA已经批准使用的抗PD-L1的单抗药物为罗氏(Roche/Genentech)的Atezolizumab(Tecentriq)，在临床上用于治疗膀胱癌和非小细胞肺癌。目前，临床上通常用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)实验检测肿瘤组织内肿瘤细胞中PD-L1的表达状况，其实验方法的核心为特异性结合PD-L1的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性，而且其肉眼判断的主观性不可避免。因此，研制出一种灵敏度较高的特异性针对PD-L1蛋白表达的新型检测方法具有重要的意义。传统RNA表达量检测方法，通常使用GAPDH、beta-actin、tubulin等mRNA作为参照，但由于不同组织部位参照基因表达量各不相同，以及细胞的生长状态不同引起的表达不稳定，同时通过实验验证，该标准并不能完全准确反应出待测基因表达量情况。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种实时荧光定量PCR检测PD-L1基因表达量的方法和所用的引物，以克服现有技术存在的缺陷。本专利技术首先涉及一种以待检测的PD-L1mRNA为模板的反转录引物基因序列，SEQIDNO:1，代号PD-L1RT；SEQIDNO:1：5’-CAATGGACTGTGTCAGTGTTGTAGCCCAGGGTCCACTGTGGGGGCTCCTCCAAATGTGTATCA-3’所述的反转录引物基因序列，包含了PD-L1mRNA互补序列(下划虚线序列)，并在其5’端依次连接了一段用于检测PD-L1mRNA反转录产物的探针序列(阴影序列)以及用于检测PD-L1mRNA反转录产物的反向引物序列(下划实线序列)。该引物设计可以保证在反转录产物长度较短或者二级结构较复杂时也可以使用高效的荧光定量PCR体系对其进行检测，使用实时荧光定量PCR技术检测PD-L1基因表达量。通过优化PCR反应体系和条件，使扩增效率达到最佳。本专利技术还涉及一组以PD-L1反转录cDNA为模板的特异性引物基因序列：SEQIDNO:2，代号：PD-L1F：5’-AGCTGAATTGGTCATCCCAGAA-3’SEQIDNO:3，代号：PD-L1R：5’-CAATGGACTGTGTCAGTGTTGT-3’本专利技术还涉及以PD-L1反转录cDNA为模板的特异性探针：SEQIDNO:4，代号：PD-L1P：5’-FAM-AGCCCAGGGTCCACTGTGGGGG-TAMRA-3’本专利技术还涉及一组参照基因RPPH1的特异性引物基因序列：SEQIDNO:5，代号：RPPH1F：5’-CGTTCTCTGGGAACTCACCT-3’SEQIDNO:6，代号：RPPH1R：5’-TCCTGTCACTCCACTCCCAT-3’本专利技术还涉及一组参照基因RPPH1的特异性探针：SEQIDNO:7，代号：RPPH1P：5’-HEX-AGCCCTGTTAGGGCCGCCTCTGG-TAMRA-3’所述的参照基因RPPH1为RibonucleasePRNAComponentH1，该基因在文献：JForensicSci.2009Mar；54(2):305-19.中已经有详细的描述，本专利技术不再赘述；本专利技术还涉及一种标准品的基因序列，SEQIDNO:8；本专利技术还涉及一种反转录产物cDNA与参照基因RPPH1等比例连接构成的PCR克隆载体，用作参照基因以及待测目的基因的标准品：将参照基因与待测mRNA反转录产物cDNA片段等比例连接，克隆到同一个质粒载体上，构建一种可同时用于参照基因以及待测mRNA反转录产物cDNA扩增检测的标准品，并将所得标准品，按照浓度梯度稀释后，用于绘制参照基因以及待测目的基因的标准曲线，所述等比例为1:1；所述的克隆载体为pMD18-TVector(Takara)，该克隆载体在文献WuGW,TangM,etal.TheepitopestructureofCitrustristezaviruscoatproteinmappedbyrecombinantproteinsandmonoclonalantibodies.Virology.2014Jan5；448:238-46.中有详细描述。本专利技术所述的实时荧光定量PCR检测PD-L1基因表达量的方法，包括如下步骤：(1)反转录反应：提取样本中的RNA/DNA，提取方法为常规的，可参见QIAGEN公司的AllPrepDNA/RNAMiniKit说明书，以待检测的mRNA片段作为模板，通过所述的反转录引物基因序列SEQIDNO:1(PD-L1RT)，在反转录酶的作用下，自模板的3’端向5’端进行延伸反应，合成第一链cDNA，其中，所述反转录引物是具有热稳定性的DNA单链，由三部分组成：i)5’端特异性序列，与QPCR的正向引物序列一致，由22个碱基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.以待检测的PD-L1mRNA为模板的反转录引物基因序列，如SEQ ID NO:1所示。/n
【技术特征摘要】
1.以待检测的PD-L1mRNA为模板的反转录引物基因序列，如SEQIDNO:1所示。
2.一组以PD-L1反转录cDNA为模板的特异性引物基因序列，如SEQIDNO:2，和SEQIDNO:3所示。
3.一组以PD-L1反转录cDNA为模板的特异性探针，如SEQIDNO:4所示。
4.一组参照基因RPPH1的特异性引物基因序列，如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6，所示。
5.参照基因RPPH1的特异性探针，如SEQIDNO:7所示。
6.标准品的基因序列，如SEQIDNO:8所示。
7.实时荧光定量PCR检测PD-L1基因表达量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)反转录反应：同步提取样本中的RNA/DNA，以待检测的mRNA片段作为模板，通过权利要求1所述的反转录引物基因序列SEQIDNO:1在反转录酶的作用下，自模板的3’端向5’端进行延伸反应，合成第一链cDNA；
(2)实时荧光定量PCR扩增反应：分别采用cDNA对应的特异性引物SEQIDNO:2、SEQIDNO:3及参照基因对应的特异性引物SEQIDNO:4、SEQIDNO:5为扩增引物，SEQIDNO:4、SEQIDNO:7为...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐向荣，唐志君，张冀申，
申请(专利权)人：上海康派尼恩医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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