检测CDH1基因的多个位点突变的引物、方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了检测CDH1基因的多位点碱基突变的引物，方法和试剂盒，包括扩增CDH1基因的c.2076T>C、c.1937‑13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA位点突变的引物；采用Sanger测序技术，可用于快速检测遗传性胃癌患者体内CDH1基因的c.2076T>C、c.1937‑13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA位点突变情况。利用本发明专利技术完成的检测结果准确，对遗传性胃癌的临床鉴别诊断有重要的参考意义。

Primers, methods and kits for detecting multiple site mutations in CDH1 gene

【技术实现步骤摘要】
检测CDH1基因的多个位点突变的引物、方法和试剂盒
本专利技术属生命科学和生物
，特别涉及检测CDH1基因位点突变的引物，采用普通PCR结合Sanger测序技术，可用于快速检测遗传性胃癌患者体内CDH1基因位点的突变情况。
技术介绍
中国是胃癌高发国家，全世界42％的胃癌发生在我国，是第三大常见肿瘤(在男性中排在肺癌和肝癌之后，女性排在乳腺癌和肺癌之后)。胃癌人群中大多数为散发病例，约10％的患者表现有家族聚集性，这种聚集性可能与基因有关，也可能是由于共同的生活环境和饮食习惯所致，而HDGC(hereditarydiffusegastriccancer，遗传性弥漫型胃癌)是已知的以胃腺癌为主的癌症综合征，占所有胃癌总数的1-3％。CDH1基因突变是HDGC遗传的主要原因，也是第一个发现的与遗传性胃癌相关的基因。CDH1是一个抑癌基因，位于16q22.1，由16个外显子组成，长度约105kb，转录mRNA长4.8kb，编码的E-钙粘蛋白(E-cadherin)分子量为120kd。E-cadherin是一类Ca2+依赖跨膜糖蛋白，由N端信号肽、前肽和成熟蛋白三部分组成，是目前公认的抑癌蛋白和肿瘤转移抑制蛋白，当它表达减少或功能异常时，将导致肿瘤的侵袭和转移。E-钙粘素在弥漫性胃癌中经常表达缺失，但是在其他类型胃癌中并没有这种现象。至今已发现有150多种CDH1基因的突变类型，遍布CDH1基因的所有外显子。其中70％左右为致病型突变，包括截短突变(truncatedmutation)、剪接突变(splicingmutation)、无义突变(nonsensemutation)；30％左右为错义突变(missensemutation)，其临床意义还有争议。CDH1基因突变率在不同地区、种族的遗传性弥漫型胃癌检出差别很大，提示不同地区胃癌的发病机制可能不同。符合遗传性胃癌诊断标准的家系中，CDH1基因突变携带者一生中患胃癌的概率大约为70％。弥漫性胃癌一旦出现临床症状，大部分已不可治愈，因此遗传性胃癌家系的CDH1基因检测成为必要。其目的是尽可能明确发病原因，并对有发病危险的家族成员提供遗传性检测，以便早期发现突变基因携带者，及时采取干预措施以提高预后。Sanger测序法是基因检测的主要手段之一，也是基因检测的金标准。通过测序法对CDH1基因突变进行检测可发现CDH1基因已知和未知的全部类型的异常，为遗传性胃癌患者的诊断提供依据。本专利技术中发现CDH1基因的c.2076T>C、c.1937-13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA四个位点的突变在中国人群中普遍存在。因此，临床在利用CDH1基因突变辅助诊断遗传性胃癌时需格外谨慎，加以区别。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测CDH1基因的c.2076T>C、c.1937-13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA位点突变的引物，采用PCR技术，可用于快速检测遗传性胃癌家系成员体内CDH1基因的c.2076T>C、c.1937-13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA位点的突变情况。所述检测CDH1基因的c.2076T>C、c.1937-13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA位点突变情况的引物，包括：扩增CDH1基因的c.2076T>C、c.1937-13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA位点的引物，其碱基序列为：CDH1-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGCTTGCGGGTGTCTTTAGCDH1-R：AACAGCTATGACCATGTCCAGGAAATAAACCTCCTCC。进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13R：AACAGCTATGACCATG。本专利技术还提供了检测CDH1基因的c.2076T>C、c.1937-13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA位点突变情况的方法，包括以下步骤：1.抽提外周血或肌肉组织中的基因组DNA；2.用PCR扩增步骤1中提取的DNA；3.对步骤2中的扩增产物进行测序；4.对测序结果进行判断，确定CDH1基因的c.2076T>C、c.1937-13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA位点是否发生突变；其中PCR扩增引物为：扩增CDH1基因的c.2076T>C、c.1937-13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA位点的引物，其碱基序列为：CDH1-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGCTTGCGGGTGTCTTTAGCDH1-R：AACAGCTATGACCATGTCCAGGAAATAAACCTCCTCC。进一步地，测序引物碱基序列为：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13R：AACAGCTATGACCATG。本专利技术还提供了一种检测CDH1基因的c.2076T>C、c.1937-13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA位点突变的试剂盒，包括：(i)血液/组织DNA抽提试剂；(ii)检测体系PCR扩增反应液：包括扩增CDH1基因的c.2076T>C、c.1937-13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA位点的引物，其碱基序列为：CDH1-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGCTTGCGGGTGTCTTTAGCDH1-R：AACAGCTATGACCATGTCCAGGAAATAAACCTCCTCC；(iii)测序体系试剂：包括测序引物，其碱基序列为：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13R：AACAGCTATGACCATG；(iv)阳性对照品和阴性对照品。有益效果：本专利技术只用1对引物，可同时检测CDH1基因c.2076T>C、c.1937-13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA4个突变，高效简便。其中还发现了c.2164+66A>C这个新突变(未见文献报道，属首次发现)，在本次检测中突变率为60％。本专利技术采用PCR技术，通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳，构建了稳定的扩增体系。相比较荧光定量PCR法降低了检测的成本和难度，荧光定量PCR法要针对不同的突变类型设计4个探针，成本高，检测难度大。附图说明图1为扩增引物的琼脂糖凝胶电泳图，M为MarkerDL2000，1-20为血液样本1-20，经引物扩增有效，且目的条带清晰本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测CDH1基因的c.2076T>C、c.1937-13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA位点突变情况的引物，其特征在于，包括：/nCDH1-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGCTTGCGGGTGTCTTTAG/nCDH1-R：AACAGCTATGACCATGTCCAGGAAATAAACCTCCTCC。/n

【技术特征摘要】
1.检测CDH1基因的c.2076T>C、c.1937-13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA位点突变情况的引物，其特征在于，包括：
CDH1-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGCTTGCGGGTGTCTTTAG
CDH1-R：AACAGCTATGACCATGTCCAGGAAATAAACCTCCTCC。


2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，还包括测序引物，其碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。


3.检测CDH1基因的c.2076T>C、c.1937-13T>C、c.2164+66A>C和c.2164+17dupA位点突变情况的方法，包括以下步骤：
(1)抽提外周血或肌肉组织中的基因组DNA；
(2)用PCR扩增步骤1中提取的DNA；
(3)对步骤2中的扩增产物进行测序；
(4)对测序结果进行判断，确定CDH1基因的c.2076、c.1937-13、c.2164+66和c.2164+17位点是否发生突变；
其中PCR扩增引物为：
CDH1-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGCTTGCGGG...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈雪青，李允章，王淑一，
申请(专利权)人：北京艾迪康医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11