一种快速分析CYP2C9基因型的方法技术

一种快速分析CYP2C9基因型的方法，包括：（1）提取DNA样本；（2）对样本进行预处理：（2

【技术实现步骤摘要】
一种快速分析CYP2C9基因型的方法


[0001]本专利技术属于基因检测
，具体涉及一种快速分析CYP2C9基因型的方法。

技术介绍

[0002]细胞色素氧化酶P450(CYP)是人类肝脏中一种重要药物代谢酶系统,能代谢多种内源性底物、药物和外源性化合物,主要包括三种超家族：CYP1、CYP2和CYP3。其中CYP2C是目前研究最广泛、性质最清楚的亚家族。CYP2C9是CYP2C亚家族中的一种同功酶，主要分布在肝脏组织，约占肝微粒体CYP酶总量的20%。大约10%的临床常用药物经由CYP2C9氧化代谢，其中包括甲苯磺丁脲、S
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华法林、苯妥因、格列甲嗪、格列苯脲、托拉噻咪、络沙坦、厄贝沙坦和许多非甾体类抗炎药物。
[0003]CYP2C9基因具有遗传多态性，导致CYP2C9酶活性存在差异，这是药物代谢种族与个体差异的原因之一。具有功能意义的基因突变导致CYP2C9酶活性降低，可使CYP2C9酶底物药物疗效下降或产生更多不良反应。近年来,研究发现越来越多的单碱基突变,迄今为止已发现30个等位基因，这些新的等位基因在人群中的分布频率及功能意义已受到越来越多的关注。
[0004]人类CYP2C9基因启动子区和基因编码区域存在高度多态性,不同等位基因频率在不同种族不同。经由CYP2C9氧化代谢的药物治疗时，药物代谢和药效存在个体差异,这种现象与CYP2C9存在高度基因多态性有关。体内体外证据表明CYP2C9*2、*3、*5、*11、*13、*14、*16、*24、*26、*28和*30能显著地损害CYP2C9的催化功能,但他们对酶活性的影响存在底物特异性。当采用CYP2C9底物药物如:华法林硝苄香豆素、格列甲嗪等这些具有较窄治疗指数的药物治疗时,那些CYP2C9弱代谢者,尤其是CYP2C9*3 纯合子携带者,可能会出现严重的药物毒性反应。相反的,当采用经CYP2C9代谢的前体药物(如氯沙坦和环磷酰胺等)治疗时,CYP2C9弱代谢者可能会出现药物疗效不足或治疗失败。
[0005]因此用药前对CYP2C9基因进行检测,可以指导医生根据患者的基因型调整CYP2C9底物药物的剂量,实现个体化药物治疗,提高药物疗效和降低不良反应发生率。
[0006]申请公告号为CN111118144A的文件公开了一种同时检测CYP2C9和VKORC1基因的试剂盒及其应用，可同时检测CYP2C9基因A1075C位点和VKORC1基因
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G>A位点的多态性，结合INR检测值调整维持剂量，从而作为血液抗凝治疗者服用华法林的初始剂量和维持剂量的参考，降低法华林用药的副反应和风险。
[0007]高通量测序技术（High
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throughput
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sequencing）是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next
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generation
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sequencing)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep
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sequencing)。高通量测序技术极大地加速了基因组学研究的进展，全基因组测序或者全外显子测序可以提供更全面的基因组学信息，而且随着高通量测序技术的发展，它带来的方便以及福利不断地展现出来，而且已经成为临床诊断和科研的热点。
[0008]授权公告号为CN112029842B的文件公开了一种基于高通量测序进行ABO血型基因分型的试剂盒和方法，可以获得覆盖ABO基因全长90.92%区域，包括ABO基因全部7个外显子区域的测序数据，可以更加精确地完成ABO血型基因分型。但是目前还没有关于CYP2C9基因多态位点的高通量测序检测。

技术实现思路

[0009]针对上述存在的问题，本专利技术的目的是提供一种快速分析CYP2C9基因型的方法，可以实现同时检测多个位点，并通过分析软件对序列进行分析，以判断基因型，从而指导临床用药的目的。
[0010]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种快速分析CYP2C9基因型的方法，至少包括以下步骤：（1）提取DNA样本；进一步地，根据样本量的多少，选择合适的提取方法和试剂进行提取，少量样本可采用柱提法进行DNA提取，样本量较多的情况下可选用自动化提取方式进行DNA提取。更进一步地，少量样本可采用提取试剂盒（天根生物），样本量较多采用核酸提纯仪（艾康生物）。
[0011]（2）对DNA样本进行预处理：（2
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1）对DNA样本进行打断、末端修复、添加末端A，获得DNA片段；（2
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2）将步骤（2
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1）得到的DNA片段进行预扩增和纯化，得到预扩增产物；（3）对预扩增产物进行杂交捕获：（3
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1）将得到的所有预扩增产物混合，加入预杂交试剂后进行杂交扩增；（3
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2）将步骤（3
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1）得到的产物进行捕获清洗，然后进行扩增和纯化；（4）文库pooling和测序：（4
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1）计算每个文库的pooling体积然后排序，按顺序将所有文库进行混合；（4
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2）将混合的文库进行上机测序，获得测序数据；（5）对测序数据进行预处理，然后进行数据分析，判断CYP2C9基因型。
[0012]作为本专利技术的进一步优选，步骤（2
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1）中DNA打断的PCR反应条件为：PCR仪热盖温度68~72℃，32℃反应22min，65℃反应30min。
[0013]作为本专利技术的进一步优选，步骤（2
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2）中预扩增的PCR反应条件为：PCR仪热盖温度104~106℃，98℃，45s，1个循环；98℃，15s、60℃，30s、72℃，30s，共8个循环；72℃，1min，1个循环；然后降温至4℃。
[0014]作为本专利技术的进一步优选，步骤（3
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1）的PCR反应条件为：PCR仪热盖温度84~86℃，95℃，反应5min；60℃，反应1~4h。
[0015]作为本专利技术的进一步优选，步骤（3
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2）的PCR反应条件为：PCR仪热盖温度104~106℃，98℃，45s，1个循环；98℃，15s、60℃，30s、72℃，30s，共12个循环；72℃，1min，1个循环；然后降温至4℃。
[0016]作为本专利技术的进一步优选，步骤（5）中数据分析包括以下步骤：（5
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1）采用序列比对模块将测序序列比对到人类参考基因组上；（5
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2）使用变异鉴定模块分析样本中的点突变和插入缺失突变；（5
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3）利用数据库对突变位点进行SNP分析和解读。
[0017]作为本专利技术的进一步优选，步骤（5
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1）中序本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速分析CYP2C9基因型的方法，其特征在于，至少包括以下步骤：（1）提取DNA样本；（2）对DNA样本进行预处理：（2
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1）对DNA样本进行打断、末端修复、添加末端A，获得DNA片段；（2
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2）将步骤（2
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1）得到的DNA片段进行预扩增和纯化，得到预扩增产物；（3）对预扩增产物进行杂交捕获：（3
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1）将得到的所有预扩增产物混合，加入预杂交试剂后进行杂交扩增；（3
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2）将步骤（3
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1）得到的产物进行捕获清洗，然后进行扩增和纯化；（4）文库pooling和测序：（4
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1）计算每个文库的pooling体积然后排序，按顺序将所有文库进行混合；（4
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2）将混合的文库进行上机测序，获得测序数据；（5）对测序数据进行预处理，然后进行数据分析，判断CYP2C9基因型。2.根据权利要求1所述的一种快速分析CYP2C9基因型的方法，其特征在于，步骤（2
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1）中DNA打断的PCR反应条件为：PCR仪热盖温度68~72℃，32℃反应22min，65℃反应30min。3.根据权利要求1所述的一种快速分析CYP2C9基因型的方法，其特征在于，步骤（2
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2）中预扩增的PCR反应条件为：PCR仪热盖温度104~106℃，98℃，45s，1个循环；98℃，15s、60℃，30s、72℃，30s，8个循环；72℃，1min，1个循环；...

【专利技术属性】
技术研发人员：张伟，
申请(专利权)人：北京艾迪康医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：