circRNAs分子在制备肝癌诊断试剂盒中的应用及应用该分子的试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种circRNAs分子在制备肝癌诊断试剂盒中的应用，具体的说在于提供一种基于hsa_circ_0028185表达检测的肝癌诊断策略和应用。包括用于肝癌诊断的hsa_circ_0028185荧光定量PCR检测试剂盒。本发明专利技术检测试剂盒提供一种hsa_circ_0028185测诊断肝细胞肝癌的标准。本发明专利技术方法是通过检测血清中hsa_circ_0028185表达变化的情况，预警肝组织的癌变是否发生及肝癌的发生发展情况，为肝癌的确诊及预后、靶向肿瘤代谢的个体化治疗提供必要的依据。

Application of circrnas in the preparation of liver cancer diagnostic kit

【技术实现步骤摘要】
circRNAs分子在制备肝癌诊断试剂盒中的应用及应用该分子的试剂盒
本专利技术涉及一种circRNAs分子在试剂盒中的应用及试剂盒，特别涉及circRNAs分子在肝癌诊断试剂盒中的应用及试剂盒，属于生物医药领域。
技术介绍
肝细胞肝癌是全世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，发病率位列全世界第四位，且在世界范围内逐年上升；而死亡率位居各大恶性肿瘤的第三位。我国一直是肝细胞肝癌的高发区，每年新增患者数约占全球约55％。由于缺乏有效的筛查手段，导致60％-70％的肝癌患者诊断时已处于晚期，错失根治性切除机会。可见，早期诊断，早期治疗是增加肝癌患者生存率，降低肝癌死亡率最有效的途径。血清学标志物的检测有助于肝细胞肝癌早期诊断、疗效观察及术后随访、复发或预后评估等。但肝细胞肝癌血清标志物众多，尚没有一个特异性、敏感性俱佳的理想指标。根据《原发性肝癌诊疗规范(2017年版)》，甲胎蛋白(AFP)是当前临床应用最广泛的肝细胞肝癌肿瘤标志物，但长期的临床实践表明，AFP灵敏度(40％～65％)和特异性(76％～96％)却不甚令人满意，仍存在约40％的漏诊率及一定的误诊率。尽管超声、CT、MRI等影像学检查方法可以作为AFP检测的补充，但由于检查费用昂贵，而且这些方法的检出率依赖于肿瘤大小及操作者的经验等因素，因而可能出现误诊、漏诊的情况。因此，发现新的高敏感性、高特异性，且低廉又易于检测的肝癌早期诊断标志物具有重要的临床意义。环状RNA(circRNAs)是一类呈闭合环状结构，不具有5'末端帽子和3'末端尾巴的特殊内源性非编码RNA分子，主要由外显子转录产物组成，具有结构稳定、丰度高及组织特异性表达等特征。其主要功能除作为miRNA“海绵”，竞争性结合miRNA发挥转录后调控作用；还与细胞核内核糖核蛋白或RNA聚合酶II相互作用调控转录；或直接与转录因子结合，调控经典的RNA剪接；编码蛋白质等，并可通过多种作用方式参与基因表达调控。近年来的研究表明，异常表达的circRNAs分子参与了肿瘤的发生与发展过程。由于circRNAs具有高度保守性、组织特异性与阶段特异性的特点；同时，circRNAs闭合环状的特殊结构，可逃避核酸外切酶降解，使其在血液、体液中可稳定存在。因此，循环circRNA具有作为肿瘤等疾病无创性生物标志物的潜能，适用于高危人群筛查。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种有效诊断肝癌的诊断标志物以及应用该标志物的诊断试剂盒。为了解决上述问题，本专利技术提供了一种circRNAs分子在制备肝癌诊断试剂盒中的应用，所述circRNAs分子为hsa_circ_0028185。hsa_circ_0028185为人体肝癌分子标志物。所述肝癌诊断试剂盒以hsa_circ_0028185作为诊断标记物，所述肝癌诊断试剂盒是通过荧光定量PCR技术检测疑似肝癌患者外周静脉血中hsa_circ_0028185的水平，所述hsa_circ_0028185与肝癌呈正相关。提出了一种用于实时荧光定量PCR检测肝癌细胞标志物的试剂盒，包含检测hsa_circ_0028185表达水平的试剂。所述检测hsa_circ_0028185表达水平的试剂包含一对通过实时荧光定量PCR特异性扩增hsa_circ_0028185的引物，其引物序列为：F:5’-GCAGAGTCCAAGAAGCAATAATC-3’R:5’-CTCGTGCCAGTAGGTAGCCAT-3’。本专利技术通过试验及结果分析发现，肝细胞肝癌患者血清中hsa_circ_0028185表达上调，提示hsa_circ_0028185是肝细胞肝癌中的高表达circRNAs。本专利技术中提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强、操作简单的特点，适合各类医院推广使用。附图说明图1血清circRNA芯片聚类分析肝细胞肝癌患者vs.健康体检者血清中差异表达的circRNAs，发现hsa_circ_0028185在肝细胞肝癌患者血清中呈高表达(n＝4)。图2实时荧光定量PCR法检测hsa_circ_0028185及内参18s的熔解曲线。图3与及健康对照者相比，肝细胞肝癌患者血血清hsa_circ_0028185表达水平升高(p＝0.005)。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术进行进一步详细说明。实施例1：血清circRNAs芯片表达分析。一、材料和方法1、在患者知情的情况下，采用含促凝剂和分离胶的真空采集管采集4例肝细胞肝癌患者和4例健康对照者各5ml外周静脉血，血样在室温(15-25℃)放置1小时处理后3,000r/min离心15min，吸取1ml血清，置于无菌EP管内，-80℃冻存备用。2、采用ArraystarHumancircRNAMicroarray芯片检测血清circRNAs的表达。芯片检测交给上海康成生物有限公司完成，包括RNA提取和质量控制，样品使用荧光标记探针标记，探针与芯片杂交反应，芯片洗涤与结果扫描数据采集等步骤。使用AglientFeatureExtractionv11.0软件获得芯片图谱及原始数据。最后使用AglientGeneSpringGXv12.1对原始数据进行标准化，再筛选出高质量的探针，即保留在8个样本中均被标记的探针进行下一步分析，初步筛选出两组样本中差异表达circRNAs谱。二、结果关于血清circRNA芯片聚类分析见图1。芯片筛查发现在肝细胞肝癌患者vs.健康对照者血清中差异表达的circRNAs中，hsa_circ_0028185在肝细胞肝癌患者血清中呈显著高表达，鉴于其可能在肝细胞肝癌患者血清中存在特异性表达，本专利技术通过以下实施例采用大规模样本进行该指标的重复验证。实施例2：qRT-PCR验证hsa_circ_0028185在肝细胞肝癌患者和健康对照者血清中的差异表达。一、材料和方法1、在患者知情的情况下，采用含促凝剂和分离胶的真空采集管采集50例肝细胞肝癌患者、30例良性肝病对照者和35例健康对照者各5ml外周静脉血，血样在室温(15-25℃)放置1小时处理后3,000r/min离心15min，吸取1ml血清，置于无菌EP管内，-80℃冻存备用。2、引物设计：从Ensemble数据库提取hsa_circ_0028185相关的转录本序列，并用根据转录本的序列通过NCBI的引物设计工具(PrimerBLAST)设计引物；F:5’-GCAGAGTCCAAGAAGCAATAATC-3’R:5’-CTCGTGCCAGTAGGTAGCCAT-3’。3、血清总RNA的提取：按北京BioTake有限公司的血清总RNA提取试剂盒说明书提取样本中血清总RNA。使用德国Nanodrop1000紫外可见分光光度计测定所提取的RNA浓度和纯度。4、逆转录合成cDNA：使用High-CapacitycDNA逆转录试剂盒(Invitrogen)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.circRNAs分子在制备肝癌诊断试剂盒中的应用，其特征在于：所述circRNAs分子为hsa_circ_0028185。/n

【技术特征摘要】
1.circRNAs分子在制备肝癌诊断试剂盒中的应用，其特征在于：所述circRNAs分子为hsa_circ_0028185。


2.如权利要求1所述的circRNAs分子在制备肝癌诊断试剂盒中的应用，其特征在于：所述肝癌诊断试剂盒以hsa_circ_0028185作为诊断标记物，所述肝癌诊断试剂盒是通过荧光定量PCR技术检测疑似肝癌患者外周静脉血中hsa_circ_0028185的水平，所述hsa_circ_0028185与肝癌呈正相关。


3.用于实时...

【专利技术属性】
技术研发人员：施维，王峰，李祎，刘若雨，季伙燕，
申请(专利权)人：南通大学附属医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32