序列特异性阻断剂结合特定PCR程序检测肿瘤基因突变的方法技术

本发明专利技术公开了一种应用序列特异性阻断剂(SSHB)结合特定PCR扩增程序高敏感检测低频肿瘤基因突变的检测方法，包括引物、探针、SSHB的设计，Buffer和Taq酶的选择，以及特定的PCR扩增程序。本发明专利技术设计了SSHB，结合特定的反应程序(每个扩增循环中包含高低两个退火温度)，在高退火温度下阻断剂优先和野生型模板进行充分结合且ARMS引物不和野生型模板结合，在低退火温度下阻断剂和突变型模板不结合或者极少量结合且ARMS引物和突变型模板充分结合，从而能够降低野生型背景的扩增，同时极大地提高突变型的检测效率(可以检测出0.1％的突变频率)，可应用到肿瘤基因突变的检测中，可对点突变、插入突变、缺失突变等进行检测。

Detection of tumor gene mutation by sequence specific blocker combined with specific PCR program

【技术实现步骤摘要】
序列特异性阻断剂结合特定PCR程序检测肿瘤基因突变的方法
本专利技术涉及一种应用序列特异性阻断剂(SSHB)结合特定PCR程序高敏感检测肿瘤基因低频突变的方法，属于基因检测

技术介绍
肿瘤细胞的基因突变主要分为胚系突变和体细胞突变，后者在基因检测中需要检测出低频率的基因突变，主要的样本类型有组织样本和血液样本等。体细胞突变组织活检是目前癌症诊断的金标准，也是肿瘤基因分型的一种方法，但由于肿瘤的异质性和疾病的进展，组织活检对肿瘤的进展、预后、治疗和基因分型的监测有一定的局限性。血浆循环肿瘤DNA(circulatingtumorDNA，ctDNA)是存在于血浆或血清中的单或双链DNA，片段大小约167bp左右。研究表明ctDNA具有许多癌症相关的分子特性，基于ctDNA的液体活检对基因突变的筛查具有高敏感性和特异性，可持续动态观测肿瘤的进展。利用ctDNA的检测能准确检测肿瘤的基因突变，有利于肿瘤的早期发现，还能准确判断肿瘤的进展、预后及协助靶向治疗。肿瘤基因体细胞突变检测技术可分为两个阶段：第一阶段为基于PCR技术的检测技术，如直接测序法(Sanger法)、微滴数字化PCR(dropletdigitalPCRSystem，ddPCR)、突变扩增阻滞系统(amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)法等，第二阶段为在NGS基础上发展起来的检测方法。Sanger法利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止，每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。Sanger法对取材要求比较高，同时由于测序方法本身的限制，其灵敏度也不高，通常只能检测到15％～20％的突变基因，这种技术在组织样本中会出现大量的假阳性，而且无法应用到液态活检中。数字PCR(DigitalPCR)作为DNA定量的新技术，是将一个标准的PCR反应分配到大量微小的反应器中，在每个反应器中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，实现单分子模板PCR扩增，扩增结束后，通过阳性反应器的数目“数出”目标序列的拷贝数，这种方法的优点是可以对ctDNA进行绝对定量，灵敏度可达到单个核酸分子，检测限低至0.001％，但同时也存在只能检测已知的突变位点、通量低且成本高的缺点。ARMS法是利用PCR引物的3′端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3′末端碱基与模板配对时才能出现PCR扩增，从而检测出突变。ARMS方法检测灵敏度明显高于直接测序法等其他方法，利用qPCR的△CT值可检测出样品中含量低至1％的突变基因。现已成为国际上肿瘤个体化分子检测最重要的技术之一，其在临床应用中的优势已被业内专家广泛认可。但是引物3′末端碱基与不配对时也会出现扩增，不同的突变碱基变化其扩增效率具有一定的随机性(部分和完全配对引物相比扩增效率差别比较大，即qPCR中的△CT值大；部分和完全配对引物相比扩增效率差别比较小，即qPCR中的△CT值小，甚至为0)，部分1％突变频率基因位点在在检测应用中的准确度无法满足要求。基于Block阻断剂和ARMS引物来检测突变位点已经有相应的文献或者专利报道，Block阻断剂是一段与野生型模板DNA完全互补的单链核酸序列，其末端进行了封闭而无法扩增。Block阻断剂不能有效地区分突变型模板和野生型模板，尽管有一个碱基(突变位点)的差别，在常规的引物退火温度下，Block阻断剂主要和野生型模板结合，同时也会和突变型模板结合，从而降低了野生型的封闭效率和突变型的检测效率。一种基于Blocker引物和ARMS引物检测基因突变的方法和试剂盒(专利公开号CN107419018A)中为提高Blocker引物的封闭效率对Blocker进行了改良，使Blocker引物的Tm值比突变检测引物的退火温度高5～25℃，该方法极大的增强了Blocker对野生型的封闭效率，但是同时也极大的减弱了突变型在低频突变时候的检出率。
技术实现思路
针对上述现有技术，为了提高ARMS+Blocker技术中阻断剂对野生型模板封闭效果和突变型模板的检出率，本专利技术提供了一种应用序列特异性阻断剂(SequenceSpecificHigh-Blocker,SSHB)结合特定PCR扩增程序高敏感检测低频肿瘤基因突变的检测方法。本专利技术设计了SSHB，结合特定的反应程序(每个扩增循环中包含高低两个退火温度)，在高退火温度下阻断剂优先和野生型模板进行充分结合且ARMS引物不和野生型模板结合，在低退火温度下阻断剂和突变型模板不结合或者极少量结合且ARMS引物和突变型模板充分结合，从而能够降低野生型背景的扩增(50～100ng野生型基因组模板在qPCR中无荧光信号)，同时极大地提高突变型的检测效率(可以检测出5～10ng基因组核酸中0.1％的突变频率)。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种应用序列特异性阻断剂结合PCR检测肿瘤基因低频突变的方法，包括以下步骤：(1)基因序列的确定：确定目标基因序列及突变位点位置及该位点上下游100bp以内所有SNP人群突变频率；可以根据UCSC确定目标基因序列，通过NCBI确定突变位点以及SNP人群突变频率；(2)引物的设计：利用PrimerPremier5软件设计引物；引物可以在正向链或者反向链设计，根据突变位点附近的SNP进行选择，保证引物内不含有高频的SNP位点，下游引物同样选择不含有高频的SNP位点；引物的长度为17～30nt，Tm值56～62℃，扩增的长度尽量不超过120bp；进一步地，所述引物，包括检测位点的引物和内参引物(两者扩增同一个基因序列，但是扩增的序列无相互交叉)，检测位点的上游引物可以是ARMS引物(3’端与突变型生型模板DNA配对作为反应体系的上游引物)或普通引物(不包含突变位点)；选择无基因突变位点和不含有高频SNP多态性的位置作为检测位点的下游引物和内参基因的上下游引物；(3)SSHB的设计：利用PrimerPremier5软件设计阻断剂，阻断剂优先选择和检测位点的上游引物在同一条链上进行设计，阻断剂以野生型模板进行设计，其突变位点优先位于阻断剂的中间1/3位置(此阻断剂与野生型模板结合的退火温度会最大化的高于与突变型模板结合的退火温度)；阻断剂的5’端和检测位点的上游引物的3’端有连续5～20个碱基完全相同(ARMS引物末端碱基除外；在扩增循环中，第一步退火阻断剂优先和野生型模板结合后，第二步退火检测位点的上游引物因阻断剂的空间占位无法与野生型模板结合，从而无法扩增野生型模板)，退火温度比检测位点的上游引物高1～4.9℃；阻断剂的3’端使用C3spacer或其它的封闭基团进行封闭；(4)检测探针的设计：利本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种应用序列特异性阻断剂结合特定PCR程序检测肿瘤基因低频突变的方法，其特征在于：包括以下步骤：/n(1)基因序列的确定：确定目标基因序列及突变位点位置及该位点上下游100bp以内所有SNP人群突变频率；/n(2)引物的设计：利用软件设计引物，保证引物内不含有高频的SNP位点，下游引物同样选择不含有高频的SNP位点；引物的长度为17～30nt，Tm值56～62℃；/n(3)SSHB的设计：利用软件设计阻断剂，阻断剂以野生型模板进行设计，阻断剂的5’端和检测位点的上游引物的3’端有连续5～20个碱基完全相同，ARMS引物末端碱基除外，退火温度比检测位点的上游引物高1～4.9℃；阻断剂的3’端使用C3spacer或其它的封闭基团进行封闭；/n(4)检测探针的设计：利用软件设计检测探针，探针位于阻断剂的下游相隔1～20个碱基；检测探针的Tm值为65～72℃；/n(5)反应Buffer和Taq酶的选择：选择合适的反应Buffer和Taq酶，保证buffer满足引物、阻断剂的Tm值接近软件设计的温度；Taq酶选择无3’外切酶活性的热启动Taq酶；/n(6)检测样本的准备：培养含有突变位点和不含有突变位点的肿瘤细胞系作为检测样本，分别提取核酸，不含有突变位点的肿瘤细胞系核酸作为野生型对照样本，含有突变位点的肿瘤细胞系核酸作为阳性样本，并使用野生型对照样本进行梯度稀释；/n(7)PCR体系的确定：调整PCR体系组成对突变阳性样本和野生对照样本进行荧光定量PCR扩增，设定荧光信号检测终点；所述PCR扩增的程序为：1)预变性95℃，5min；2)变性94℃，15S；第一步退火64～66℃，15S；第二步退火60℃，15S；扩增收集荧光信号72℃，30S；共45个循环。/n...

【技术特征摘要】
1.一种应用序列特异性阻断剂结合特定PCR程序检测肿瘤基因低频突变的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)基因序列的确定：确定目标基因序列及突变位点位置及该位点上下游100bp以内所有SNP人群突变频率；
(2)引物的设计：利用软件设计引物，保证引物内不含有高频的SNP位点，下游引物同样选择不含有高频的SNP位点；引物的长度为17～30nt，Tm值56～62℃；
(3)SSHB的设计：利用软件设计阻断剂，阻断剂以野生型模板进行设计，阻断剂的5’端和检测位点的上游引物的3’端有连续5～20个碱基完全相同，ARMS引物末端碱基除外，退火温度比检测位点的上游引物高1～4.9℃；阻断剂的3’端使用C3spacer或其它的封闭基团进行封闭；
(4)检测探针的设计：利用软件设计检测探针，探针位于阻断剂的下游相隔1～20个碱基；检测探针的Tm值为65～72℃；
(5)反应Buffer和Taq酶的选择：选择合适的反应Buffer和Taq酶，保证buffer满足引物、阻断剂的Tm值接近软件设计的温度；Taq酶选择无3’外切酶活性的热启动Taq酶；
(6)检测样本的准备：培养含有突变位点和不含有突变位点的肿瘤细胞系作为检测样本，分别提取核酸，不含有突变位点的肿瘤细胞系核酸作为野生型对照样本，含有突变位点的肿瘤细胞系核酸作为阳性样本，并使用野生型对照样本进行梯度稀释；
(7)PCR体系的确定：调整PCR体系组成对突变阳性样本和野生对照样本进行荧光定量PCR扩增，设定荧光信号检测终点；所述PCR扩增的程序为：1)预变性95℃，5min；2)变性94℃，15S；第一步退火64～66℃，15S；第二步退火60℃，15S；扩增收集荧光信号72℃，30S；共45个循环。


2.根据权利要求1所述的应用序列特异性阻断剂结合特定PCR程序检测肿瘤基因低频突变的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，可以根据UCSC确定目标基因序列，通过NCBI确定突变位点以及SNP人群突变频率。


3.根据权利要求1所述的应用序列特异性阻断剂结合特定PCR程序检测肿瘤基因低频突变的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，引物在正向链或者反向链设计，根据突变位点附近的SNP进行选择，保证引物内不含有高频的SNP位点，下游引物同样选择不含有高频的SNP位点；引物的长度为17～30nt，Tm值56～62℃，扩增的长度不超过120bp。


4.根据权利要求1所述的应用序列特异性阻断剂结合特定PCR程序检测肿瘤基因低频突变的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述引物包括检测位点的引物和内参引物，检测位点的上游引物是ARMS引物或普通引物；选择无基因突变位点和不含有高频SNP多态性的位置作为检测位点的下游引物和内参基因的上下游引物。


5.根据权利要求1所述的应用序列特异性阻断剂结合特定PCR程序检测肿瘤基因低频突变的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，利用PrimerPremier5软件设计阻断剂，阻断剂选择和检测位点的上游引物在同一条链上进行设计，阻断剂以野生型模板进行设计，其突变位点位于阻断剂的中间1/3位置；阻断剂的5’端和检测位点的上游引物的3’端有连续5～20个碱基完全相同，ARMS引物末端碱基除外，退火温度比检测位点的上游引物高1～4.9℃；阻断剂的3’端使用C3spacer进行封闭。


6.根据权利要求1所述的应用序列特异性阻断剂结合特定PCR程序检测肿瘤基因低频突变的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，利用PrimerPremier5软件设计检测探针，探针选择和阻断剂在同一条链上进行设计，探针位于阻断剂的下游相隔1～20个碱基；检测探针为水解型探针，Tm值为65～72℃。


7.根据权利要求1所述的应用序列特异性阻断剂结合特定PCR程序检测肿瘤基因低频突变的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，反应Buffer选择大连宝生物货号为9151a的buffer。


8.根据权利要求1所述的应用序列特异性阻断剂结合特定PCR程序检测肿瘤基因低频突变的方法，其特征在于：所述步骤(6)中，使用野生型对照样本进行梯度稀释：分别配制成25％、10％、1％和0.1％突变频率的阳性样本。


9.根据权利要求1～8中任一项所述的应用序列特异性阻断剂结合特定PCR程序检测肿瘤基因低频突变的方法，其特征在于：所述待检测的目标基因为基因位点BRAF(V600E)；
引物的Tm值56～62℃；检测探针为taqman水解型探针，对探针5’端F...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨海星，徐明，王连水，绳红丹，张超，杨蕾，王晓红，刘长胜，
申请(专利权)人：银丰基因科技有限公司，银丰生物工程集团有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37