一种骨肉瘤干细胞标志物及其应用、试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种骨肉瘤干细胞标记物LIF及其应用。LIF在骨肉瘤组织中显著高表达，且其表达高低与骨肉瘤细胞干性有显著相关性；LIF可促进骨肉瘤细胞的生长，提示LIF可以成为骨肉瘤治疗的靶点。本发明专利技术包括LIF蛋白的应用：(1)作为骨肉瘤干细胞新的标记物用于包括转移在内的预测；(2)作为药物靶点抑制骨肉瘤干细胞的生长。本发明专利技术以LIF蛋白为生物标志物和靶向疗法为骨肉瘤治疗提供新思路，也为早期诊断和预后判断提供辅助检测指标，有重要临床应用价值。

An osteosarcoma stem cell marker and its application, kit

【技术实现步骤摘要】
一种骨肉瘤干细胞标志物及其应用、试剂盒
本专利技术属于生物医药
涉及一种与骨肉瘤干细胞相关的肿瘤标记物及其应用。
技术介绍
骨肉瘤是最常见的青少年原发恶性骨肿瘤，以手术结合新辅助化疗的综合治疗可以治愈约60％患者，仍有40％骨肉瘤患者发生远处转移治疗失败，肺转移是骨肉瘤致死的主要原因。出现肺转移的患者5年生存率低于20％，肺转移灶对现有的化疗药物不敏感，靶向药物未取得突破性的进展。因此骨肉瘤肺转移成为制约预后提高的瓶颈。如何有效早期发现并遏制骨肉瘤肺转移是亟待解决的临床问题。既往人们对骨肉瘤发病等进行了一系列探讨，但仍存在已发现的标志物灵敏度不高、特异性不强等缺点。为此，深入研究并阐明骨肉瘤肺转移的分子机制，找到新的骨肉瘤标志物和防治靶标并能有效干预对于控制骨肉瘤的肺转移，进一步提高骨肉瘤的疗效具有极其重要的价值。大量研究表明只有小部分具有肿瘤起始能力的癌细胞是肿瘤发生的核心起源，这一癌细胞亚群被命名为肿瘤干细胞。肿瘤干细胞具有正常干细胞的一些特征，它们可以通过细胞分裂自我更新以形成相同的子细胞并分化成各种类型的子代。而骨肉瘤患者在第一次治疗完成几十年后仍可能出现远处转移，这可能进一步突出了肿瘤干细胞的致瘤特征。骨肉瘤组织样本和细胞系中存在能够在无血清培养条件下生长肉球或骨球的细胞亚群，这些细胞表现出对化疗和辐射的治疗抗性，并表现出干细胞样特性。肿瘤干细胞与恶性肿瘤额发生、复苏、耐药性、侵袭和转移密切相关。因此，骨肉瘤干细胞的靶向治疗为骨肉瘤的治疗提供了一种有前景的策略。而目前仍未有特异性分离骨肉瘤干细胞的明确标志物，能从非骨肉瘤干细胞中分离出骨肉瘤干细胞，这就需要找到有效的骨肉瘤干细胞标记物，才能进行特异性治疗的研究。LIF(LIFinterleukin6familycytokine)基因是一种参与多系统作用基因，其编码的蛋白是一种多效性细胞因子，在不同的系统中发挥不同功能。LIF(NCBI登录号NM_002309.5，GeneID:3976)是白细胞介素家族成员之一，位于22号染色体上。近期的研究发现LIF是骨肉瘤细胞以及临床样本特异性超级增强子相关基因，因此对肿瘤发生发展有着、重要的调控作用通过用LIF重组蛋白处理骨肉瘤细胞，建立LIF刺激细胞模型，并研究其对骨肉瘤细胞生长及转移的影响。旨在探讨LIF的表达与骨肉瘤发生、自我更新、转移的关系，为进一步研究LIF对骨肉瘤的靶向治疗及调控机制奠定基础。提示LIF可作为骨肉瘤干细胞生物标记物和治疗靶点，并用于骨肉瘤辅助诊断、疗效检测、预后判断等。经检索，目前没有针对骨肉瘤中LIF的相关报道和专利申请。LIF序列如下：61atgaaggtcttggcggcaggagttgtgcccctgctgttggttctgcactggaaaca121tggggcggggagccccctccccatcacccctgtcaacgccacctgtgccatacgccaccc181atgtcacaacaacctcatgaaccagatcaggagccaactggcacagctcaatggcagtgc241caatgccctctttattctctattacacagcccagggggagccgttccccaacaacctgga301caagctatgtggccccaacgtgacggacttcccgcccttccacgccaacggcacggagaa361ggccaagctggtggagctgtaccgcatagtcgtgtaccttggcacctccctgggcaacat421cacccgggaccagaagatcctcaaccccagtgccctcagcctccacagcaagctcaacgc481caccgccgacatcctgcgaggcctccttagcaacgtgctgtgccgcctgtgcagcaagta541ccacgtgggccatgtggacgtgacctacggccctgacacctcgggtaaggatgtcttcca601gaagaagaagctgggctgtcaactcctggggaagtataagcagatcatcgccgtgttggc661ccaggccttctagNotch-1是Notch基因家族的成员之一,Notch-1信号通路在细胞的增殖、分化、生存和凋亡中起着重要作用，其异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关。Notch-1基因参与调节了细胞分化发育及调控的信号途径，并影响了细胞凋亡、增殖、分化及血管形成的效应。Notch-1受体及其配体Jagged-1的表达还常被用于癌症的诊断和预后判断。活化的Notch-1可使正常细胞向恶性转化，并在人类许多实体瘤(如宫颈癌、头颈肿瘤、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、胸膜间皮瘤和涎腺肿瘤)及血液系统肿瘤中有异常表达。异常的Notch-1信号与一些肿瘤的发生密切相关，Notch-1信号的紊乱不仅能够直接引起肿瘤的发生，而且可通过与其他多条信号通路的交互作用，以直接或间接的方式最终诱导肿瘤形成。鉴于Notch-1的异常表达和许多肿瘤的发生、发展密切相关，该信号通路可作为治疗肿瘤的新的靶点。
技术实现思路
本专利技术的首要目的是筛选出一种与骨肉瘤干细胞相关的肿瘤标志物，本标志物为DNA序列LIF基因。该序列还可在骨肉瘤辅助诊断、转移预测及预后判断和治疗中应用。所述骨肉瘤辅助诊断、疗效预测及预后判断的试剂盒中包括LIF基因的特异性引物，所述LIF基因的特异性引物的上游引物和下游引物，所述LIF基因的特异性上游引物的序列如SEQIDNO.1所示，所述LIF下游引物的序列如SEQIDNO.2所示。所述试剂盒为实时荧光定量PCR检测试剂盒。其中实时荧光定量PCR检测试剂盒中引物适用于SYBRGreen的检测。另外，试剂盒中还包括标准DNA模板和PCR反应体系，PCR反应体系中的PCR反应液为实时荧光定量PCR反应液，并进一步包含荧光染料。所述实时荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶及缓冲液，所述荧光染料为SYBRGreenII，Taq酶为热启动酶。所述参考值水平是LIF基因在正常细胞即正常人成骨细胞的表达水平，所述正常细胞与测定细胞同一品系且无癌变。所述测定细胞已知或被怀疑包含肿瘤细胞。专利技术人发现，检测LIF的引物具有良好的特异性，用于诊断骨肉瘤干细胞样特性具有很高的准确率，发现了新的可作为肿瘤干细胞标志物的基因，该基因的在肿瘤细胞和组织中显著高表达，并且其表达量与干细胞样特性显著相关，结果表明LIF是特异性的肿瘤干性标志物。在此基础上完成了本专利技术。为了验证专利技术的诊断有效性，本专利技术通过以下方法进行验证，采用RT-PCR、细胞侵袭、药物处理的方法验证癌症标志物的表达特征及其对骨肉瘤细胞生长功能的影响。实验方法主要包括以下几个部分：1.应用ChIP-seq技术探索骨肉瘤中特异性的增强子；应用RT-PCR技术在正常骨组织和骨肉瘤组织中验证基因表达差异：提取骨肉瘤及其癌旁本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.LIF基因作为骨肉瘤生物标记物的应用，其特征在于LIF基因在骨肉瘤组织中高表达。/n

【技术特征摘要】
1.LIF基因作为骨肉瘤生物标记物的应用，其特征在于LIF基因在骨肉瘤组织中高表达。


2.一种骨肉瘤检测试剂盒，其中包含检测LIF表达的试剂，其是用于骨肉瘤辅助诊断、疗效预测及预后判断的试剂盒。


3.如权利要求2所述的骨肉瘤检测试剂盒，所述的检测LIF表达的试剂是特异性检测LIFmRNA的探针或引物，或者是特异性结合LIF蛋白的抗体。


4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括上游检测引物和下游检测引物，上游检测引物序列为SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵蔚，邹昌业，鲁冰，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44