多重检测BRAF基因突变的试剂盒及方法技术

本发明专利技术提供了多重检测BRAF基因突变的试剂盒及方法，具体的地，本发明专利技术公开了一种多重检测BRAF基因突变的引物、探针及包括该引物探针混合液的试剂盒，能够同时检测肺癌BRAF基因的5种突变类型，本发明专利技术的方法和试剂盒具有检测过程简单、可检突变类型多、灵敏度高、样本依赖性小等优点。

Kit and method for multiple detection of BRAF gene mutation

【技术实现步骤摘要】
多重检测BRAF基因突变的试剂盒及方法
本专利技术属于生物技术和肿瘤诊断领域，具体地说，本专利技术涉及多重检测BRAF基因突变的试剂盒及方法。
技术介绍
肺癌是发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌(NSCLC)数量约占所有肺癌患者的85％，晚期非小细胞肺癌患者的5年生存率约为15％。随着技术的发展，肿瘤中发生的基因突变越来越受到人们重视，非小细胞肺癌具有高度的异质性，导致其临床表现及治疗效果极其多样化。BRAF基因功能编码区由2510对碱基组成，位于人类染色体7q34，编码MAPK通路中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，该酶将信号从RAS转导至MEK1/2，从而参与细胞调控。在多种恶性肿瘤细胞中都有发现BRAF基因突变。这些突变主要发生于编码激活区的外显子15上，其中约92％位于第1799位核苷酸上(1799T>A)，导致其编码的缬氨酸被谷氨酸取代(V600E)。除了肺癌外，BRAF在结肠癌、黑色素瘤、甲状腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的突变。近年的研究结果表面，BRAF突变除了是预测性指标之外，还是一个预后指标。例如，有研究结果显示，BRAF突变的mCRC患者预后不良。因此，临床实践中，如果KRAS基因无突变时，必须检测排除BRAF基因突变，如果后者存在V600E突变，则不应该给予抗EGFR单抗治疗。目前基因突变常用的检测方法包括：sanger测序法、荧光PCR法、高分辨溶解曲线法、高通量测序法等。①sanger测序法：检测基因突变需要对待测样品扩增、纯化、测序、序列分析，过程操作繁琐、耗时长，且对取材和技术要求比较高，并且由于自身的限制导致其灵敏度不高，仅可检测丰度超过20％的突变，假阴性较多。②荧光PCR法：目前常用的基因突变检测方法，检测灵敏度高，可检出样品中含量低至1％的突变基因，且大幅缩短目标产物的长度，可解决石蜡包埋组织样本提取的DNA片段化的难题，从而获得较为准确的检测结果。荧光PCR法操作简单，能极大的避免扩增产物的污染。但该方法多用于检测单基因突变，多重基因检测在检测位点增多的同时设计难度成倍增加，因此虽然荧光PCR法拥有众多优点，但多重基因突变检测产品极少。③高分辨率溶解曲线分析(HRM)：基于核酸的物理性质，通过饱和染料结合于PCR扩增产物，监控产物溶解曲线的变化分析基因突变。检测敏感性在5％左右，对于阳性结果并不能确认具体位置，最终需要测序确认。④高通量测序法：高通量测序法价格昂贵，读长大约30-250bp，比Sanger测序短，对序列拼接造成了负担，检测结果仍需要Sanger测序验证，并且对于检测外显子与内含子交界区的小片段缺失的准确性不够。高通量测序法操作繁琐，限制了测序速度。因此，本领域迫切需要开发能够有效检测肺癌患者BRAF基因突变的技术以满足临床准确、快捷、低成本的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种多重检测BRAF基因突变的试剂盒及方法。在本专利技术的第一方面，提供了一种用于多重检测BRAF基因突变的引物对集，所述引物对集包括：如SEQIDNO.:1所示的正向引物；和，如SEQIDNO.:6所示的反向引物。在另一优选例中，所述引物对集还包括：SEQIDNO.:2所示的正向引物；和/或，SEQIDNO.:3所示的正向引物；和/或，SEQIDNO.:4所示的正向引物；和/或，SEQIDNO.:5所示的正向引物。在另一优选例中，所述引物对集包括：如SEQIDNO.:1、SEQIDNO.:2、和SEQIDNO.:3所示的正向引物；以及，如SEQIDNO.:6所示的反向引物。在另一优选例中，所述引物对集包括：如SEQIDNO.:1、SEQIDNO.:2、SEQIDNO.:3、SEQIDNO.:4、和SEQIDNO.:5所示的正向引物；以及，如SEQIDNO.:6所示的反向引物。在另一优选例中，所述引物对集还包括(内标)：如SEQIDNO.:8所示的正向引物；和，如SEQIDNO.:9所示的反向引物本专利技术的第二方面，提供了一种多重检测BRAF基因突变的探针组，所述探针组包括核苷酸序列如SEQIDNO.:7所示的突变探针。在另一优选例中，所述探针组还包括核苷酸序列如SEQIDNO.:10所示的内控探针。在另一优选例中，所述突变探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，所述突变探针的3’端包含有荧光淬灭基团。在另一优选例中，所述内控探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，所述内控探针的3’端包含有荧光淬灭基团。在另一优选例中，所述突变探针标记的荧光报告基团不同于所述内控探针标记的荧光报告基团。本专利技术的第三方面，提供了一种用于多重检测BRAF基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括本专利技术第一方面所述的引物对集。在另一优选例中，所述试剂盒还包括本专利技术第二方面所述的探针组。在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含SEQIDNO.:1-10所示的多核苷酸序列。在另一优选例中，使用PCR用缓冲液(Buffer)配制所述引物探针混合液。在另一优选例中，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器内包含DNA酶系，所述DNA酶系包括热启动酶、UNG酶、和dNTPs。在另一优选例中，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含阳性质控品。在另一优选例中，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含阴性质控品。本专利技术的第四方面，提供了一种多重检测BRAF基因突变的方法，所述方法包括步骤：(1)提供待检测对象的DNA样本；(2)制备PCR反应体系并进行PCR检测：其中，所述PCR反应体系包括：步骤(1)提供的所述DNA样本、本专利技术第一方面所述的引物对集、和本专利技术第二方面所述的探针组。在另一优选例中，PCR反应体系包含引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含SEQIDNO.:1-10所示的多核苷酸序列。在另一优选例中，所述DNA样本可来自石蜡包埋组组、新鲜组织、胸腹水及血浆游离核酸。在另一优选例中，所述方法为非诊断目的的检测方法。在另一优选例中，所述PCR反应体系还包括阳性质控品，和/或阴性质控品。在另一优选例中，所述PCR反应体系还包括DNA酶系；和/或PCR用缓冲液。本专利技术的第五方面，提供了本专利技术第一方面所述的引物对集、和/或本专利技术第二方面所述的探针组的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测BRAF基因突变。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1BRAF基因突变检测灵敏度图；图2实例3中临床样本检测结果典型阳性示例1；图3实例3中临床样本检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于多重检测BRAF基因突变的引物对集，其特征在于，所述引物对集包括：/n如SEQ ID NO.:1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.:6所示的反向引物。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于多重检测BRAF基因突变的引物对集，其特征在于，所述引物对集包括：
如SEQIDNO.:1所示的正向引物；和，如SEQIDNO.:6所示的反向引物。


2.如权利要求1所示的引物对集，其特征在于，所述引物对集还包括选自下组的一个或多个引物序列：
SEQIDNO.:2所示的正向引物；
SEQIDNO.:3所示的正向引物；
SEQIDNO.:4所示的正向引物；和
SEQIDNO.:5所示的正向引物。


3.如权利要求1所示的引物对集，其特征在于，所述引物对集包括：如SEQIDNO.:1、SEQIDNO.:2、和SEQIDNO.:3所示的正向引物；以及，如SEQIDNO.:6所示的反向引物。


4.如权利要求1所示的引物对集，其特征在于，所述引物对集包括：如SEQIDNO.:1、SEQIDNO.:2、SEQIDNO.:3、SEQIDNO.:4、和SEQIDNO.:5所示的正向引物；以及，如SEQIDNO.:6所示的反向引物。


5.如权利要求1所示的引物对集，其特征在于，所述引物对集还包括(内标)：
如SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋析文，邓洁，朱小亚，黄志文，钟灵秀，
申请(专利权)人：中山大学达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44