一种猪苓质量的检测方法及其指纹图谱的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种猪苓指纹图谱的构建方法、一种猪苓质量的检测方法、一种检测猪苓多糖的单糖组成的方法以及一种猪苓多糖提取物的分离方法。本发明专利技术所述猪苓质量的检测方法应用了能反映猪苓多糖的单糖组成特征的猪苓指纹图谱，可有效地检测分析猪苓汤剂及其配方颗粒的质量。本发明专利技术所述方法操作简单、稳定、重现性好、检测效率高，具有较强实用性。

A method for the quality detection of Polyporus umbellatus and the construction of its fingerprint

【技术实现步骤摘要】
一种猪苓质量的检测方法及其指纹图谱的构建方法
本专利技术涉及质量分析领域，具体涉及一种猪苓质量的检测方法及其指纹图谱的构建方法。
技术介绍
猪苓为伞形多孔菌科真菌Polyporusumbellatus(Pers.)Fr.的干燥菌核，其味甘、淡，性平，具有利水渗湿之功效，用于小便不利，水肿，泄泻，淋浊，带下等，作为药食同源物品其在保健功能食品中也多有应用。猪苓的主要化学成分为多糖及甾体类成分，现代研究认为：猪苓多糖具有抗肿瘤和提高机体免疫力的作用，其免疫刺激作用与TLR4信号通路的激活有关；而麦角甾醇和麦角甾酮则是利尿作用的主要活性成分。2015年版《中国药典》一部“猪苓”项下仅以麦角甾醇为含量测定项(含量标准不足千分之一)，且中医药方剂多采用水煎煮法，在猪苓的水煎液及其配方颗粒中几乎检测不到麦角甾醇，因此其内在质量很难有效评定。而对于其多糖的分析方法，目前多采用苯酚-浓硫酸显色分光光度法测定，方法的专属性不佳，难以作为有效的质量控制方法。吴优等应用单糖PMP衍生化，毛细管电泳的方法检测猪苓多糖的单糖组成(吴优等，高效毛细管电泳法分析猪苓多糖中的单糖组成，黑龙江大学自然科学学报，2013,30(2):220～224)，只鉴定了4个单糖，不足以表征猪苓多糖的特征；且相比于毛细管电泳法，高效液相色谱法应用更普遍，实用性更强。现有研究中为了尽可能多的提取出中药药材的更多化学成分，进行质量控制时常采用有机溶剂提取的方式；以水溶性成分作为质量控制的研究较少。对于多糖一般采用苯酚-硫酸法测总多糖含量，不能表征特征性(例如参见不同产地野生猪苓多糖与麦角甾醇的含量分析，李香串等，中国野生植物资源，2014,33(4)：11～16)。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺乏有效的针对猪苓质量的检测方法，提供了一种猪苓指纹图谱的构建方法、一种猪苓质量的检测方法、一种检测猪苓多糖的单糖组成的方法以及一种猪苓多糖提取物的分离方法。本专利技术所述猪苓质量的检测方法应用了能反映猪苓多糖的单糖组成特征的猪苓指纹图谱，可有效地检测分析猪苓汤剂及其配方颗粒的质量。本专利技术所述方法操作简单、稳定、重现性好、检测效率高，具有较强实用性。本专利技术收集不同产地二十余批次的猪苓药材，采用水煎煮法对其水溶性多糖逐一进行单糖组成的研究，通过单糖的衍生化提高HPLC的检测灵敏度，并且进行大量实验摸索出了本专利技术所述的HPLC的流动相比例，较好实现对猪苓的单糖组成的分析。为解决上述技术问题，本专利技术旨在提供一种猪苓指纹图谱的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：(1)利用高效液相色谱检测猪苓的供试品溶液，(2)将检测结果生成指纹图谱；所述高效液相色谱的色谱柱为反相柱；所述高效液相色谱为使用流动相的体积比为15:85至20:80的乙腈-磷酸盐缓冲溶液进行等度洗脱；所述供试品溶液的制备包括：通过水煎煮法制得猪苓水溶性粗多糖；将所得粗多糖经酸水解后，以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮进行衍生化处理，萃取后取水层定容作为供试品溶液。较佳地，所述反相柱为硅胶键合相色谱柱，优选十八烷基硅烷键合色谱柱或辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱硅胶柱。较佳地，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为6.5～7.0，优选6.80。较佳地，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为30～50mmol/L，优选50mmol/L。较佳地，所述磷酸盐缓冲溶液为KH2PO4-NaOH缓冲溶液。较佳地，所述流动相的流速为0.8～1.2ml/min，优选1ml/min。较佳地，所述反相柱的柱温为25～30℃，优选30℃。较佳地，所述流动相的体积比为18:82或17.5:82.5。较佳地，所述高效液相色谱的检测波长为240～250nm，优选250nm。较佳地，所述高效液相色谱的进样体积为10～20μL，优选10μL。较佳地，所述十八烷基硅烷键合色谱柱的柱长为150～250mm，优选250mm；和/或，所述十八烷基硅烷键合色谱柱的内径为2.1～4.6mm，优选4.6mm；和/或，所述十八烷基硅烷键合色谱柱的填料粒径为3～5μm，优选5μm；更佳地，所述十八烷基硅烷键合色谱柱为AgilentExtendC18，4.6*250mm，5μm。较佳地，所述水煎煮法包括以下步骤：(1)将猪苓通过水煎煮制得样品，(2)将(1)中所得样品进行后处理；所述后处理通过以下方法之一进行：方法一为将所述样品经浓缩或水溶，和乙醇混合后进行沉淀后冷冻干燥即得猪苓水溶性粗多糖，方法二为将所述样品通过微孔滤膜但不通过超滤膜部分，干燥即得猪苓水溶性粗多糖；更佳地，所述乙醇的体积占混合后溶液总体积的80％～90％。较佳地，所述酸水解为将酸性溶液和所得粗多糖混合后进行加热的步骤，所述加热的方式优选为水浴，所述加热的温度优选为90～100℃，更优选为90℃；所述加热的时间优选为4～6h，更优选为6h；所述酸性溶液优选为盐酸、三氟乙酸或硫酸。较佳地，所述衍生化处理包括与氢氧化钠溶液和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液混合后，再进行加热的步骤，所述1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液与氢氧化钠溶液的体积比优选为大于等于1，所述加热的方式优选为水浴，所述加热的温度优选为60～70℃，更优选为70℃；所述加热的时间优选为30～40min，更优选为30min。较佳地，所述萃取的萃取剂为氯仿。为解决上述技术问题，本专利技术旨在提供一种猪苓质量的检测方法，所述检测方法为根据如权利要求1所述的构建方法生成待测猪苓样品的指纹图谱，所得指纹图谱具有8个特征峰并且其中7个特征峰为甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖，所述待测猪苓样品即为合格产品。较佳地，以所述葡萄糖的特征峰为对照，所述甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖的特征峰的相对保留时间分别为0.50±5％min、0.64±5％min、0.69±5％min、1.00±5％min、1.14±5％min、1.21±5％min、1.44±5％min。较佳地，所述待测猪苓样品为猪苓汤剂或猪苓配方颗粒。为解决上述技术问题，本专利技术旨在提供一种检测猪苓多糖的单糖组成的方法，所述方法为利用高效液相色谱检测猪苓的供试品溶液；所述高效液相色谱的色谱柱为反相柱；所述高效液相色谱为使用流动相的体积比为15:85至20:80的乙腈-磷酸盐缓冲溶液进行等度洗脱；所述供试品溶液的制备包括：通过水煎煮法制得猪苓水溶性粗多糖；将所得粗多糖经酸水解后，以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮进行衍生化处理，萃取后取水层定容作为供试品溶液。较佳地，所述反相柱为硅胶键合相色谱柱，优选十八烷基硅烷键合色谱柱或辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱硅胶柱。较佳地，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为6.5～7.0，优选6.80。较佳地，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为30～50mmol/L，优选50mmol/L。较佳地，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪苓指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：(1)利用高效液相色谱检测猪苓的供试品溶液，(2)将检测结果生成指纹图谱；/n所述高效液相色谱的色谱柱为反相柱；/n所述高效液相色谱为使用流动相的体积比为15:85至20:80的乙腈-磷酸盐缓冲溶液进行等度洗脱；/n所述供试品溶液的制备包括：通过水煎煮法制得猪苓水溶性粗多糖；将所得粗多糖经酸水解后，以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮进行衍生化处理，萃取后取水层定容作为供试品溶液。/n

【技术特征摘要】
1.一种猪苓指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：(1)利用高效液相色谱检测猪苓的供试品溶液，(2)将检测结果生成指纹图谱；
所述高效液相色谱的色谱柱为反相柱；
所述高效液相色谱为使用流动相的体积比为15:85至20:80的乙腈-磷酸盐缓冲溶液进行等度洗脱；
所述供试品溶液的制备包括：通过水煎煮法制得猪苓水溶性粗多糖；将所得粗多糖经酸水解后，以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮进行衍生化处理，萃取后取水层定容作为供试品溶液。


2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述反相柱为硅胶键合相色谱柱，优选十八烷基硅烷键合色谱柱或辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱硅胶柱；
和/或，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为6.5～7.0，优选6.80；
和/或，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为30～50mmol/L，优选50mmol/L；
和/或，所述磷酸盐缓冲溶液为KH2PO4-NaOH缓冲溶液；
和/或，所述流动相的流速为0.8～1.2ml/min，优选1ml/min；
和/或，所述反相柱的柱温为25～30℃，优选30℃；
和/或，所述流动相的体积比为18:82或17.5:82.5；
和/或，所述高效液相色谱的检测波长为240～250nm，优选250nm；
和/或，所述高效液相色谱的进样体积为10～20μL，优选10μL。


3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述水煎煮法包括以下步骤：(1)将猪苓通过水煎煮制得样品，(2)将(1)中所得样品进行后处理；
所述后处理通过以下方法之一进行：方法一为将所述样品经浓缩或水溶，和乙醇混合后进行沉淀后冷冻干燥即得猪苓水溶性粗多糖，方法二为将所述样品通过微孔滤膜但不通过超滤膜部分，干燥即得猪苓水溶性粗多糖；
较佳地，所述乙醇的使用占混合后溶液总体积的80％～90％。


4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述酸水解为将酸性溶液和所得粗多糖混合后进行加热的步骤，所述加热的方式优选为水浴，所述加热的温度优选为90～100℃，更优选为90℃；所述加热的时间优选为4～6h，更优选为6h；所述酸性溶液优选为盐酸、三氟乙酸或硫酸；
和/或，所述衍生化处理包括与氢氧化钠溶液和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液混合后，再进行加热的步骤，所述1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液与氢氧化钠溶液的体积比优选为大于等于1，所述加热的方式优选为水浴，所述加热的温度优选为60～70℃，更优选为70℃；所述加热的时间优选为30～40min，更优选为30min；
和/或，所述萃取的萃取剂为氯仿。


5.一种猪苓质量的检测方法，其特征在于，所述检测方法为根据如权利要求1所述的构建方法生成待测猪苓样品的指纹图谱，所得指纹图谱具有8个特征峰并且其中7个特征峰为甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖，所述待测猪苓样品即为合格产...

【专利技术属性】
技术研发人员：华茉莉，刘洁，徐云辉，周靖，张倩倩，
申请(专利权)人：上海医药工业研究院，中国医药工业研究总院，
类型：发明
国别省市：上海;31