一种茯苓质量的检测方法及其指纹图谱的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种茯苓指纹图谱的构建方法、一种茯苓质量的检测方法、一种检测茯苓多糖的单糖组成的方法以及一种茯苓多糖提取物的分离方法。本发明专利技术所述茯苓质量的检测方法应用了能反映茯苓多糖的单糖组成特征的茯苓指纹图谱，可有效地检测分析茯苓汤剂及其配方颗粒的质量。本发明专利技术所述方法操作简单、稳定、重现性好、检测效率高，具有较强实用性。

A method for the quality detection of Poria cocos and the construction of its fingerprint

【技术实现步骤摘要】
一种茯苓质量的检测方法及其指纹图谱的构建方法
本专利技术涉及质量分析领域，具体涉及一种茯苓质量的检测方法及其指纹图谱的构建方法。
技术介绍
茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，其味甘、淡，性平，具有利水渗湿、健脾宁心之功效，应用历史悠久且在中医临床有“十药九茯苓”之说，同时其作为传统药食同源物品在保健功能食品也有广泛应用。对于茯苓的质量评价，一直缺乏有效的质量分析方法，至2015年版《中国药典》一部“茯苓”项下仍未建立相应的生物活性物质检测项。已有研究显示茯苓中含有多糖、三萜、甾体、蛋白质、矿物质等化学成分，现一般认为多糖及三萜类是其主要和重要的生物活性物质。针对茯苓中三萜类成分的分析检测方法，已有较多研究，如“波长转换RP-HPLC法同时测定茯苓不同部位中5种三帖酸含量”(车爽等，药学学报，2010，45(4)：494～497)、“20个产地茯苓三萜成分RP-HPLC-ELSD指纹图谱”(昝俊峰等，中国实验方剂学杂志，2013年，19(21)：65～68)等，但关键问题是茯苓药材中三萜类成分含量极低，较高含量也不过万分之几，对HPLC(高效液相色谱法)检测器的灵敏度要求较高，且中医药方剂多采用水煎煮法，而在茯苓的水煎液及其配方颗粒中几乎检测不到茯苓药材中所含三萜酸类化学成分，难以纳入质量检测方法。针对茯苓多糖的分析方法，目前多采用苯酚-浓硫酸显色分光光度法测定，方法的专属性不佳，难以作为有效的质量控制方法。吴建元等人用PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)柱前衍生-HPLC的方法检测了茯苓的碱溶性多糖，发现茯苓碱溶性多糖为均多糖，只由一种单糖，即葡萄糖组成，不具有特征性，不能表征茯苓的特征(吴建元等，医药导报，2009,28(9)：1213～1214)。现有研究中为了尽可能多的提取出中药药材的更多化学成分，进行质量控制时常采用有机溶剂提取的方式。由于水煎煮法得到的成分含量少、多糖收率较低(例如参见茯苓中多糖的提取及含量测定，周燕霞等，天然产物研究与开发，2003,15(4):330～333)，现有技术中对茯苓的水溶性成分研究较少，用水溶性成分对茯苓进行质量评价的文献迄今未检索到。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺乏有效的针对茯苓质量的检测方法，提供了一种茯苓指纹图谱的构建方法、一种茯苓质量的检测方法、一种检测茯苓多糖的单糖组成的方法以及一种茯苓多糖提取物的分离方法。本专利技术所述茯苓质量的检测方法应用了能反映茯苓多糖的单糖组成特征的茯苓指纹图谱，可有效地检测分析茯苓汤剂及其配方颗粒的质量。本专利技术所述方法操作简单、稳定、重现性好、检测效率高，具有较强实用性。本专利技术收集不同产地二十余批次的茯苓药材，采用水煎煮法对其水溶性多糖逐一进行单糖组成的研究，通过单糖的衍生化提高HPLC的检测灵敏度，并且进行大量实验摸索出了本专利技术所述的HPLC的流动相比例，较好实现对茯苓的单糖组成的分析。为解决上述技术问题，本专利技术旨在提供一种茯苓指纹图谱的构建方法所述构建方法包括以下步骤：(1)利用高效液相色谱检测茯苓的供试品溶液，(2)将检测结果生成指纹图谱；所述高效液相色谱的色谱柱为反相柱；所述高效液相色谱为使用流动相的体积比为15:85至20:80的乙腈-磷酸盐缓冲溶液进行等度洗脱；所述供试品溶液的制备包括：通过水煎煮法制得茯苓水溶性粗多糖；将所得粗多糖经酸水解后，以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮进行衍生化处理，萃取后取水层定容作为供试品溶液。较佳地，所述反相柱为硅胶键合相色谱柱，优选十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱或辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱。较佳地，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为6.5～7.0，优选6.80。较佳地，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为30～50mmol/L，优选50mmol/L。较佳地，所述磷酸盐缓冲溶液为KH2PO4-NaOH缓冲溶液。较佳地，所述流动相的流速为0.8～1.2ml/min，优选1ml/min。较佳地，所述反相柱的柱温为25～30℃，优选30℃。较佳地，所述流动相的体积比为18:82或17.5:82.5。较佳地，所述高效液相色谱的检测波长为240～250nm，优选250nm。较佳地，所述高效液相色谱的进样体积为10～20μL，优选10μL。较佳地，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的柱长为150～250mm，优选250mm；和/或，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的内径为2.1～4.6mm，优选4.6mm；和/或，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的填料粒径为3～5μm，优选5μm；更佳地，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为AgilentExtendC18，4.6*250mm，5μm。较佳地，所述水煎煮法包括以下步骤：(1)将茯苓通过水煎煮制得样品，(2)将(1)中所得样品进行后处理；所述后处理通过以下方法之一进行：方法一为将所述样品经浓缩或水溶，和乙醇混合后进行沉淀后冷冻干燥即得茯苓水溶性粗多糖，方法二为将所述样品通过微孔滤膜但不通过超滤膜部分，干燥即得茯苓水溶性粗多糖；更佳地，所述乙醇的体积占混合后溶液总体积的80％～90％。较佳地，所述酸水解为将酸性溶液和所得粗多糖混合后进行加热的步骤，所述加热的方式优选为水浴，所述加热的温度优选为90～100℃，更优选为90℃；所述加热的时间优选为4～6h，更优选为6h；所述酸性溶液优选为盐酸、三氟乙酸或硫酸。较佳地，所述衍生化处理包括与氢氧化钠溶液和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液混合后，再进行加热的步骤，所述1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液与氢氧化钠溶液的体积比优选为大于等于1，所述加热的方式优选为水浴，所述加热的温度优选为60～70℃，更优选为70℃；所述加热的时间优选为30～40min，更优选为30min。较佳地，所述萃取的萃取剂为氯仿。为解决上述技术问题，本专利技术旨在提供一种茯苓质量的检测方法，所述检测方法为根据如权利要求1所述的构建方法生成待测茯苓样品的指纹图谱，所得指纹图谱具有甘露糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖的5个特征峰，所述待测茯苓样品即为合格产品。较佳地，以所述葡萄糖的特征峰为对照，所述甘露糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖5个特征峰的相对保留时间分别为0.50±5％min、0.61±5％min、1.00±5％min、1.16±5％min、1.47±5％min。较佳地，所述待测茯苓样品为茯苓汤剂或茯苓配方颗粒。为解决上述技术问题，本专利技术旨在提供一种检测茯苓多糖的单糖组成的方法，所述方法为利用高效液相色谱检测茯苓的供试品溶液；所述高效液相色谱的色谱柱为反相柱；所述高效液相色谱为使用流动相的体积比为15:85至20:80的乙腈-磷酸盐缓冲溶液进行等度洗脱；所述供试品溶液的制备包括：通过水煎煮法制得茯苓水溶性粗多糖；将所得粗多糖经酸水解后，以1-苯基-3-甲基-5-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种茯苓指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：(1)利用高效液相色谱检测茯苓的供试品溶液，(2)将检测结果生成指纹图谱；/n所述高效液相色谱的色谱柱为反相柱；/n所述高效液相色谱为使用流动相的体积比为15:85至20:80的乙腈-磷酸盐缓冲溶液进行等度洗脱；/n所述供试品溶液的制备包括：通过水煎煮法制得茯苓水溶性粗多糖；将所得粗多糖经酸水解后，以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮进行衍生化处理，萃取后取水层定容作为供试品溶液。/n

【技术特征摘要】
1.一种茯苓指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：(1)利用高效液相色谱检测茯苓的供试品溶液，(2)将检测结果生成指纹图谱；
所述高效液相色谱的色谱柱为反相柱；
所述高效液相色谱为使用流动相的体积比为15:85至20:80的乙腈-磷酸盐缓冲溶液进行等度洗脱；
所述供试品溶液的制备包括：通过水煎煮法制得茯苓水溶性粗多糖；将所得粗多糖经酸水解后，以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮进行衍生化处理，萃取后取水层定容作为供试品溶液。


2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述反相柱为硅胶键合相色谱柱，优选十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱或辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
和/或，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为6.5～7.0，优选6.80；
和/或，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为30～50mmol/L，优选50mmol/L；
和/或，所述磷酸盐缓冲溶液为KH2PO4-NaOH缓冲溶液；
和/或，所述流动相的流速为0.8～1.2ml/min，优选1ml/min；
和/或，所述反相柱的柱温为25～30℃，优选30℃；
和/或，所述流动相的体积比为18:82或17.5:82.5；
和/或，所述高效液相色谱的检测波长为240～250nm，优选250nm；
和/或，所述高效液相色谱的进样体积为10～20μL，优选10μL。


3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述水煎煮法包括以下步骤：(1)将茯苓通过水煎煮制得样品，(2)将(1)中所得样品进行后处理；
所述后处理通过以下方法之一进行：方法一为将所述样品经浓缩或水溶，和乙醇混合后进行沉淀后冷冻干燥即得茯苓水溶性粗多糖，方法二为将所述样品通过微孔滤膜但不通过超滤膜部分，干燥即得茯苓水溶性粗多糖；
较佳地，所述乙醇的体积占混合后溶液总体积的80％～90％。


4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述酸水解为将酸性溶液和所得粗多糖混合后进行加热的步骤，所述加热的方式优选为水浴，所述加热的温度优选为90～100℃，更优选为90℃；所述加热的时间优选为4～6h，更优选为6h；所述酸性溶液优选为盐酸、三氟乙酸或硫酸；
和/或，所述衍生化处理包括与氢氧化钠溶液和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液混合后，再进行加热的步骤，所述1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液与氢氧化钠溶液的体积比优选为大于等于1，所述加热的方式优选为水浴，所述加热的温度优选为60～70℃，更优选为70℃；所述加热的时间优选为30～40min，更优选为30min；
和/或，所述萃取的萃取剂为氯仿。


5.一种茯苓质量的检测方法，其特征在于，所述检测方法为根据如权利要求1所述的构建方法生成待测茯苓样品的指纹图谱，所得指纹图谱具有甘露糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖的5个特征峰，所述待测茯苓样品即为合格产品；
较佳地...

【专利技术属性】
技术研发人员：华茉莉，刘洁，徐云辉，周靖，张倩倩，
申请(专利权)人：上海医药工业研究院，中国医药工业研究总院，
类型：发明
国别省市：上海;31