骨肽及其成骨生理活性确证方法与用途技术

本发明专利技术公开了一种骨肽的成骨生理活性确证方法，包括：预测骨肽潜在致敏性，分析骨肽的抗原免疫性；建立并模拟机体胃部微环境模型，分析骨肽在胃部消化特性；建立并模拟机体肠部微环境模型，分析骨肽在肠部消化特性；建立并模拟机体Caco‑2小肠上皮细胞单层膜吸收模型，考查骨肽在小肠上皮细胞的可运载特性；分析其对Wnt/β‑catenin通路的影响。若骨肽无抗原免疫性，对胃肠部消化具有一定耐受性，可经过在小肠上皮细胞运载至作用靶点，可激活机体内Wnt/β‑catenin信号通路，则能用于功能食品中。本发明专利技术具有较好的预测和评价多肽的成骨生理活性的能力，可为指导今后利用畜禽骨胶原蛋白肽开发生物活性功能食品提供理论依据。

Osteopeptide and its osteogenic physiological activity confirmation method and Application

【技术实现步骤摘要】
骨肽及其成骨生理活性确证方法与用途
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种骨肽，特别涉及一种骨肽的成骨生理活性确证方法，更涉及骨肽的用途。
技术介绍
随着我国进入老龄化社会，居民骨质疏松症的发病率也呈逐年上升的态势，骨质疏松症所诱发的机体骨折不仅增加了老年人病残率和病死率，也加重了社会经济负担，已成为一个严重的公众健康问题。骨质疏松症是一种以骨质量减少、骨显微结构发生退化、骨脆性增加为特征的全身性机体骨代谢性疾病。临床上，治疗骨质疏松症药物包括利塞膦酸盐、对苯二甲酸、阿仑膦酸、二磷酸盐、唑来膦酸、特立帕肽等，但服用这些药物往往存在诸如食道发炎、恶心、腹痛甚至有罹患生殖系统癌变的副作用，其潜在的毒性和副作用在一定程度上限制了大范围应用。因此，寻找能够促进骨形成和逆转骨结构损伤的更安全、食物源的天然替代品正受到越来越多的关注。畜禽骨中含有丰富的胶原蛋白(主要为I型，含量约占动物鲜骨重的20％)，胶原蛋白是一种独特的结构蛋白，研究表明补充胶原蛋白肽可以增加骨胶原纤维网架的规则性和牢固性，促进钙盐有序沉积，增加骨强度和骨密度，是一种潜在的抗骨质疏松活性肽的理想来源。然而，畜禽来源蛋白质和多肽类食品对人体可能有潜在的毒性和致敏性，这会对人体健康带来不利影响，很大程度上影响消费者认可和食用。已有研究表明，蛋白经水解后产生的多肽通常不具有毒性，且相较亲本蛋白质更不具有致敏性。然而，也有部分报道小分子肽仍保留天然蛋白的部分致敏原性，具有潜在致敏性。因此，在考虑应用生物活性多肽作为功能食品添加剂的同时，明确其潜在毒性及致敏性显得尤为重要。蛋白质和多肽类食品在食用过程中往往会被广泛降解，随着进入小肠，又会被小肠上皮细胞上各种蛋白酶进一步水解，最终水解为较小的肽段并释放至细胞间质被吸收。已有研究报道，较大分子量肽段也可伴随血液循环并最终被吸收，但这部分剂量相对较低，其消化吸收机制仍不明晰。通常情况吓，生物活性物质在经胃肠消化后，其结构和功能会发生一定改变，甚至失去生物活性，因此，大多数生物活性物质进入体内后往往无法发挥其原有(体外)生物活性功能。如何系统评价和确认骨肽的成骨生理活性，以促进其开发和利用，是目前本领域的研究热点之一。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术再有一个目的是提供一种骨肽。本专利技术还有一个目的是提供一种骨肽的成骨生理活性确证方法，克服现有评价骨肽在机体成骨生理活性确证方法研究相对匮乏的缺点。本专利技术基于生物信息学、胃肠道消化模型、Caco-2小肠上皮细胞吸收模型等系统研究骨肽的消化吸收特性评价及调控细胞通路的确证方法，从而较好的预测和评价多肽的成骨生理活性的能力，为指导今后利用畜禽骨胶原蛋白肽开发生物活性功能食品提供理论依据。本专利技术还有一个目的是提供骨肽的用途。为此，本专利技术提供的技术方案为：一种骨肽，所述骨肽具有成骨活性，所述骨肽的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。一种骨肽的成骨生理活性确证方法，包括依次进行的如下步骤：步骤一、利用生物信息学方法预测骨肽的潜在致敏性，分析骨肽的抗原免疫性；步骤二、建立并模拟机体胃部微环境模型，分析骨肽在胃部消化特性；步骤三、建立并模拟机体肠部微环境模型，分析骨肽在肠部消化特性；步骤四、建立并模拟机体Caco-2小肠上皮细胞单层膜吸收模型，分析骨肽在小肠上皮细胞的可运载特性；步骤五、分析所述骨肽对Wnt/β-catenin通路的影响；若所述骨肽能够满足无抗原免疫性，且对胃肠部消化具有一定耐受性，可经过在小肠上皮细胞运载至作用靶点(可运载性)，且可激活机体内Wnt/β-catenin信号通路，则该骨肽能用于功能食品中。优选的是，所述的骨肽的成骨生理活性确证方法中，所述步骤二中，建立并模拟机体胃部微环境模型的具体步骤包括：首先配置骨肽溶液，之后将骨肽溶液置于37℃恒温水环境中，然后调节骨肽溶液pH至2.0，再向其中加入胃蛋白酶，启动模拟体外胃部消化，同时磁力搅拌器搅拌，模拟胃部蠕动一段时间，最后取出部分消化液A作为样本，分析该骨肽在胃部的消化特性。优选的是，所述的骨肽的成骨生理活性确证方法中，所述步骤三中，建立并模拟机体肠部微环境模型的具体步骤包括：首先将步骤二中剩余的溶液的pH调节至7.5，之后按照酶与底物质量比1:50向其中加入胰液素，启动模拟体外肠道消化，同时磁力搅拌器搅拌，模拟肠部蠕动一段时间，最后取出部分消化液B作为样本，分析该骨肽在肠部的消化特性。优选的是，所述的骨肽的成骨生理活性确证方法中，所述步骤四中，建立并模拟机体Caco-2小肠上皮细胞单层膜吸收模型的具体步骤包括：首先将Caco-2细胞细胞悬浮液，接种至培养小室，向培养小室顶侧AP加入细胞悬液，向培养小室底侧加入完全培养基，培养一段时间后，测定跨膜电阻值，以跨膜电阻值为参考指标，连续培养细胞12～15天直至跨膜电阻值达到最大值时，表明Caco-2小肠上皮细胞单层膜吸收模型构建成功；Caco-2细胞单层膜模型构建成功后，进行骨肽的吸收转运试验：用HBSS缓冲液清洗细胞单层膜2次，分别向AP、BP两侧加入0.5mL、1.5mL含0.05％DMSO的HBSS缓冲液，然后于体积比5％CO2、95％空气和温度37℃恒温培养30min，然后除去缓冲液，向AP侧加入0.5mL10mM骨肽，BL侧加入1.5mL含0.05％DMSO的HBSS缓冲液，继续于体积比5％CO2、95％空气和温度37℃恒温培养；其余组，在加入骨肽之前，首先向AP、BP侧分别加入0.5mL、1.5mL与细胞吸收转运相关通路促进剂和抑制剂：浓度为0.5μg/mL的细胞松弛素D、500nM的渥曼青霉素、25mM的Gly-Sar，以分析其吸收转运机制，同样培养30min后，除去缓冲液，再分别向AP侧加入0.5mL10mM骨肽溶液，向BP侧加入1.5mL含0.05％DMSO的HBSS缓冲液，2h后从BL侧取样100μL，放置-20℃保存用于检测。优选的是，所述的骨肽的成骨生理活性确证方法中，还包括对骨肽进行序列分析以获得其序列的步骤；所述步骤一中，利用AlgPred在线数据库预测骨肽的潜在致敏性；步骤二中，胃蛋白酶与骨肽的质量比为1:50，胰液素与骨肽的质量比也为1:50。优选的是，所述的骨肽的成骨生理活性确证方法中，所述胃部微环境模型于胃部模拟容器中进行，所述胃部模拟容器包括外周壁和与所述外周壁封闭连接的底部，所述外周壁由柔性材料制成，在所述外周壁上相对的两侧设置有一对挤压部，所述挤压部配置成通过同时对其进行压缩操作，而使所述外周壁在其径向上扁平化，于所述外周壁内沿其径向设置有复位弹簧，所述复位弹簧的两端对应于所述一对挤压部的位置处固定于所述外周壁的内侧，其中，所述外周壁在俯视观察下的形状呈椭圆形，所述一对挤压部和复位弹簧沿椭圆的长轴设置，且所述一对挤压部和复位弹簧位于所述胃部模拟容器的下侧，在竖直方向上距离所述底部的高度不超过所述胃部模拟容器总高本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种骨肽，其特征在于，所述骨肽具有成骨活性，所述骨肽的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种骨肽，其特征在于，所述骨肽具有成骨活性，所述骨肽的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。


2.一种骨肽的成骨生理活性确证方法，其特征在于，包括依次进行的如下步骤：
步骤一、利用生物信息学方法预测骨肽的潜在致敏性，分析骨肽的抗原免疫性；
步骤二、建立并模拟机体胃部微环境模型，分析骨肽在胃部消化特性；
步骤三、建立并模拟机体肠部微环境模型，分析骨肽在肠部消化特性；
步骤四、建立并模拟机体Caco-2小肠上皮细胞单层膜吸收模型，分析骨肽在小肠上皮细胞的可运载特性；
步骤五、分析所述骨肽对Wnt/β-catenin通路的影响；
若所述骨肽无抗原免疫性，且对胃肠部消化具有一定耐受性，可经过在小肠上皮细胞运载至作用靶点，且可激活机体内Wnt/β-catenin信号通路，则该骨肽能用于功能食品中。


3.如权利要求2所述的骨肽的成骨生理活性确证方法，其特征在于，所述步骤二中，建立并模拟机体胃部微环境模型的具体步骤包括：首先配置骨肽溶液，之后将骨肽溶液置于37℃恒温水环境中，然后调节骨肽溶液pH至2.0，再向其中加入胃蛋白酶，启动模拟体外胃部消化，同时磁力搅拌器搅拌，模拟胃部蠕动一段时间，最后取出部分消化液A作为样本，分析该骨肽在胃部的消化特性。


4.如权利要求3所述的骨肽的成骨生理活性确证方法，其特征在于，所述步骤三中，建立并模拟机体肠部微环境模型的具体步骤包括：首先将步骤二中剩余的溶液的pH调节至7.5，之后按照酶与底物质量比1:50向其中加入胰液素，启动模拟体外肠道消化，同时磁力搅拌器搅拌，模拟肠部蠕动一段时间，最后取出部分消化液B作为样本，分析该骨肽在肠部的消化特性。


5.如权利要求2所述的骨肽的成骨生理活性确证方法，其特征在于，所述步骤四中，建立并模拟机体Caco-2小肠上皮细胞单层膜吸收模型的具体步骤包括：
首先将Caco-2细胞细胞悬浮液，接种至培养小室，向培养小室顶侧AP加入细胞悬液，向培养小室底侧加入完全培养基，培养一段时间后，测定跨膜电阻值，以跨膜电阻值为参考指标，连续培养细胞12～15天直至跨膜电阻值达到最大值时，表明Caco-2小肠上皮细胞单层膜吸收模型构建成功；
Caco-2细胞单层膜模型构建成功后，进行骨肽的吸收转运试验：用HBSS缓冲液清洗细胞单层膜2次，分别向AP、BP两侧加入0.5mL、1.5mL含0.05％DMSO的HBSS缓冲液，然后于体积比5％CO2、95％空气和温度37℃恒温培养30min，然后除去缓冲液，向AP侧加入0.5mL10mM骨肽，BL侧加入1.5mL含0.05％DMSO的HBSS缓冲液，继续于体积比5％CO2、95％空气和温度37℃恒温培养；
其...

【专利技术属性】
技术研发人员：张春晖，叶孟亮，贾伟，秦晓洁，沈青山，张鸿儒，
申请(专利权)人：中国农业科学院农产品加工研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11