高效液相色谱分析复方骨肽的方法技术

高效液相色谱分析复方骨肽的方法，色谱条件如下，色谱柱：反相柱；柱温：室温；流速：１ｍｌ／ｍｉｎ；紫外检测波长：２２０－３１０ｎｍ中的任一值；流动相采用加入具有强紫外吸收性质的离子对试剂的ｐＨ稳定体系：醋酸－醋酸盐或磷酸－磷酸盐缓冲体系；离子对试剂是具有带正电荷的阳离子基团和带负电荷的阴离子基团的化合物；在上述条件下测定待测样品的液相色谱特征曲线；通过特征峰确定两种组成物的含量，有效区分骨肽与复方骨肽。本发明专利技术延长了样品的保留时间，可保证达到分析目的，得到了骨肽、复方骨肽及全蝎提取物的指纹图谱。可检测出复方骨肽中的骨肽成分和全蝎成分，并通过特征峰确定两种组成物的含量，有效区分骨肽与复方骨肽。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种药物分析方法，具体涉及一种利用反相离子对高效液相色谱分析骨肽、复方骨肽和全蝎提取物原料及制剂的方法。
技术介绍
骨肽的主要成分为从健康动物四肢骨中提取的水溶性物质，如多肽、蛋白肽、氨基酸、有机钙、磷、无机钙、无机盐、微量元素等。全蝎提取物是从全蝎中提取的水溶性物质，其主要成分类型同骨肽类似。复方骨肽是在骨肽的基础上加入一定量的全蝎提取物得到的复方制剂。现在市场上常见的有骨肽注射液(旧称骨宁注射液)和复方骨肽注射液。骨肽注射液是由健康动物四肢骨经提取制成的灭菌水溶液。复方骨肽注射液由健康猪或胎牛四肢骨与全蝎经提取制成的灭菌水溶液，即复方骨肽注射液是在骨肽注射液的基础上加入一定量的全蝎提取物制备而成。临床上用于治疗风湿、类风湿性关节炎、骨质增生、骨折等疾病。经临床验证，复方骨肽的药效作用远优于骨肽。复方骨肽注射液现在所使用的检定方法为用福林酚测定法，从回归方程中求出多肽含量；按药典中氮测定法，测定其总氮量(2000年版中国药典)。由于骨提取物与全蝎提取物成分比较接近，以往的检定方法无法区别骨肽和复方骨肽。因骨提取物与全蝎提取物的主要成分均为多肽或蛋白肽，且两种提取物的主要成分非常接近，一般的检验方法无法将两种提取物区分开来，故需要寻找一种灵敏度高、识别力强的分析方法对复方骨肽注射液中的骨肽成分和全蝎成分进行有效区别，即定性分析，并能检定出二者含量。高效液相色谱法具有灵敏度高、识别力强、操作简便的特点，对于物质的定性定量分析都有较好的效果。有文献报道利用高效液相色谱分析检定多肽、氨基酸类物质(郭晓奎等神经肽注射液氨基酸组成成分及含量测定方法的研究《生物技术》534-35，1995)。但是，由于多肽、蛋白肽、氨基酸类物质无紫外吸收，使用常用的高效液相色谱法分析方法常常难以基线分离且保留时间短，因而对复方骨肽的分析仍然没有理想的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服常用高效液相色谱法分析复方骨肽时遇到的保留时间短、难以分离，不易紫外检测的困难，采用反相离子对高效液相色谱法对骨肽、复方骨肽及复方骨肽中的全蝎成分进行定性及定量分析，对骨肽及复方骨肽原料及制剂质量进行有效监控。本专利技术的技术方案是，反相离子对高效液相色谱分析复方骨肽药品的方法，色谱条件如下，色谱柱反相柱；柱温室温；流速1ml/min(可根据具体情况进行适当调整)；紫外检测波长220-310nm中的任一值，也可以根据具体实施情况选择其他合理波长；流动相采用加入具有强紫外吸收性质的离子对试剂的pH稳定体系；该pH稳定体系为醋酸-醋酸盐缓冲体系或磷酸-磷酸盐缓冲体系，也可以是其他适宜的缓冲溶液体系；所述的离子对试剂是具有带正电荷的阳离子基团和带负电荷的阴离子基团的化合物；在上述条件下，测定待测样品的液相色谱特征曲线；通过特征峰确定两种组成物的含量，有效区分骨肽与复方骨肽。以上方案中所述的具有带正电荷的阳离子基团和带负电荷的阴离子基团的化合物，可以选自苄基三甲基氯化铵、苄基三乙基氯化铵、对羟基苯甲酸、邻苯二甲酸氢钾、苯甲酸钠、N，N-二甲基对苯二胺盐酸盐中的一种或几种。所述的反相柱为C8柱、C18柱或苯基柱。本专利技术采用反相离子对高效液相色谱以紫外吸收检测样品、延长了样品的保留时间，骨肽特征峰保留时间为4.6±0.2min；全蝎特征峰可以达到5.2±0.2min和TR＝38.5±1.0min，可以保证达到分析目的。经实验证明，采用此方法得到了骨肽、复方骨肽及全蝎提取物的指纹图谱。可以很好的检测出复方骨肽中的骨肽成分和全蝎成分，并通过特征峰确定两种组成物的含量，有效区分骨肽与复方骨肽。本专利技术操作简便，使用方便，注射剂样品可直接进样检测，其他剂型样品及原料样品经稀释、过滤等简单处理后即可进样检测，并能快速得到检测结果，适合用于对产品进行质量监控。附图说明图1为全蝎提取液的高效液相色谱图，离子对试剂为苄基三甲基氯化铵；紫外检测波长240nm；色谱柱苯基柱。图2为骨肽注射液的高效液相色谱图，色谱条件同图1。图3为全蝎提取液C8柱高效液相色谱图。图4为骨肽注射液C8柱高效液相色谱图。图5为全蝎提取液C18高效液相色谱图。图6为骨肽注射液C18高效液相色谱图。图7为全蝎提取液的高效液相色谱图，离子对试剂为苄基三甲基氯化铵；紫外检测波长230nm；色谱柱苯基柱。图8为全蝎提取液的高效液相色谱图，离子对试剂为苄基三甲基氯化铵；紫外检测波长252nm；色谱柱苯基柱。图9为全蝎提取液的高效液相色谱图，离子对试剂为苄基三甲基氯化铵；紫外检测波长275nm；色谱柱苯基柱。图10为骨肽注射液的高效液相色谱图，色谱体系中所使用的流动相为2％甲醇的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH＝4.5)含苄基三甲基氯化铵10mmol/l；紫外检测波长262nm。图11为全蝎提取液的高效液相色谱图，色谱条件同图10。图12为骨肽注射液的高效液相色谱图，色谱体系中所使用的流动相为2％甲醇的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH＝4.5)含苄基三甲基氯化铵5mmol/l；紫外检测波长262nm。图13为全蝎提取液的高效液相色谱图，色谱条件同图12。图14为骨肽注射液的高效液相色谱图，色谱体系中所使用的流动相为2％甲醇的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH＝4.5)含苄基三甲基氯化铵3mmol/l；紫外检测波长262nm。图15为全蝎提取液的高效液相色谱图，色谱条件同图14。图16为全蝎提取物定量关系的标准曲线。图17为复方骨肽注射液的高效液相色谱图。具体实施例方式实施例1离子对试剂——苄基三甲基氯化铵的色谱考察色谱条件流动相pH＝4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(0.015mol/L)含苄基三甲基氯化铵5mmol/L；流速1ml/min；紫外检测波长240nm；柱温室温。样品全蝎提取液、骨肽注射液(由南京健利达科技开发有限公司提供，批号050603)。反相柱为C8柱。取适量全蝎提取液和骨肽注射液，用流动相稀释后，分别取20μl注入色谱仪，所得色谱图参见图1、图2。结论色谱条件下骨肽和全蝎得到了明显区分，经多次重复，确定骨肽特征峰保留时间TR＝4.6±0.2min；全蝎特征峰TR＝5.2±0.2min和TR＝38.5±1.0min。实施例2几种色谱柱的比较色谱条件色谱柱分别使用Lichrospher C8、Lichrospher C18、LichrospherPhenyl色谱柱，规格均为4.6mm×300mm，5μm；流动相pH＝4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(0.015mol/L)含苄基三甲基氯化铵5mmol/L；流速1ml/min；紫外检测波长240nm；柱温室温。样品全蝎提取液(批号050603)和骨肽注射液将两种样品分别用流动相稀释一定倍数后，各取20μl分别注入三种不同的色谱体系，所得色谱图见附图1，图2，图3，图4，图5，图6。对色谱图进行分析，见表1。表1 结论各种反相柱均能够分辨全蝎特征峰，但是优选Phenyl柱。实施例3考察不同比例有机溶剂的流动相色谱条件流动相C％(C＝10、5或0)甲醇的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH＝4.5)含苄基三甲基氯化铵5mmol/L；流速1ml/min；色谱柱LichrospherPhenyl柱(4.6mm×300mm，5μm)，紫外检测波长262nm；柱温室温本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效液相色谱分析复方骨肽的方法，色谱条件如下，色谱柱：反相柱；柱温：室温；流速：１ｍｌ／ｍｉｎ；紫外检测波长：２２０－３１０ｎｍ中的任一值；流动相采用加入具有强紫外吸收性质的离子对试剂的ｐＨ稳定体系；该ｐＨ稳定体系为醋酸－醋酸盐缓冲体系或磷酸－磷酸盐缓冲体系；所述的离子对试剂是具有带正电荷的阳离子基团和带负电荷的阴离子基团的化合物；在上述条件下，测定待测样品的液相色谱特征曲线；通过特征峰确定两种组成物的含量，有效区分骨肽与复方骨肽。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：任勇，王晓洁，马学琴，朱贯臣，吉爱宁，
申请(专利权)人：南京师范大学，南京健利达科技开发有限公司，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]