一种固相合成Alloferon-2的方法技术

本发明专利技术公开了一种固相合成Alloferon‑2的方法，属于医药技术领域，所述方法包括以下步骤：1)首先向反应器中投加二氯树脂作为固相载体，而后加入第一个氨基酸，以DCM做溶剂，加入DIEA反应一段时间；2)步骤1)反应结束后DMF洗涤，加入试剂封闭未反应的‑OH；3)向步骤2)处理后的树脂中加入哌啶DMF溶液进行脱保护；4)将下一个氨基酸和HOBT的混合物投入至反应器中，加入DIC反应一段时间；5)加入哌啶DMF溶液脱保护，重复上述步骤直至延伸结束，完成多肽粗品的合成；6)向所述的多肽粗品中加入切割液，恒温震荡一段时间，乙醚离心，得到粗产物。本发明专利技术的固相合成方法合成多肽产率高，重现性好，操作简单，利于推广。

A method of solid phase synthesis of alloferon-2

【技术实现步骤摘要】
一种固相合成Alloferon-2的方法
本专利技术属于医药
，具体的说，涉及一种固相合成Alloferon-2的方法。
技术介绍
多肽通常指10-100个氨基酸脱水缩合形成的小分子，具有不同的生物活性，且来源广泛。最常见的是从陆生动物，海洋动物等提取多肽或化学方法合成多肽。目前已有60多种肽类药物上市，并有数百种新型治疗肽正在临床前和临床开发中。这一成功的关键因素是肽的高效、特异、安全的作用模式。因此，多肽药物的蓬勃的发展将于天然分子取得突破，并人工辅助。可应用传统的合理设计来改善它们的弱点，例如它们的化学和物理特性。海洋生物活性肽来源广泛，是多孔动物门、刺胞动物门、脊索动物门、刺皮动物门以及海洋真菌和细菌等在海底进行免疫不可或缺的部分。海兔毒素10是从海洋软体动物截尾海兔中分离提取的由4个氨基酸组成的线性缩肽类天然毒性蛋白。海兔毒素10及其衍生物可以抑制细胞有丝分裂，具有很强的抗肿瘤活性，已进入临床研究阶段。文蛤中富含的牛磺酸能够达到抗肿瘤的目的。李祺福等从中国鲎细胞中提取鲎素对人胃癌BGC-823细胞增殖的抑制作用。郭思政等发现鱼卵小分子多肽对SD大鼠骨髓间充质干细胞增殖作用。陆地动植物中同样含有多种肽，比如一种从蝎子的毒液中提取的36个氨基酸的多肽，对胶质瘤、黑色素瘤、小细胞肺癌、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤等肿瘤细胞具有靶向性。Alloferon-2是一种从双翅目丽蝇血液中提取出来的12个氨基酸的小分子多肽，其氨基酸序列为GVSGHGQHGVHG。现有研究资料表明，体外实验中，该肽对NK淋巴细胞具有刺激作用，在体内实验中，经该肽处理后，在小鼠体内诱导细胞因子产生。此外，小鼠体内实验表明，该多肽具有抗病毒和抗肿瘤的能力，这些结果表明该肽具有免疫调节特性和抗病毒效果。虽然天然提取的多肽具有较好的医药价值已被证实，然而采用天然提取的方式存在产量低，难获取的缺陷，因此采用固相合成的化学方法合成目标多肽成为有效获取多肽的有效手段。然而固相合成法也存在收率低，收率难以控制的问题，如何能够得到操作简单，产率高的合成方法是现有技术存在的难题。
技术实现思路
1.要解决的问题针对现有技术中采用天然提取方式获得Alloferon-2多肽产量低，难以获取的缺陷，本专利技术提供了一种操作步骤简单，合成产率高的固相合成Alloferon-2的制备方法。2.技术方案为了解决上述问题，本专利技术所采用的技术方案如下：本专利技术提供了固相合成多肽Alloferon-2的方法，该多肽的英文名称为Alloferon-2，分子式为C46H69N19O15，氨基酸序列为：Gly-Val-Ser-Gly-His-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly。该Alloferon-2的合成方法，具体包括以下步骤：1)首先向反应器中投加二氯树脂作为固相载体，加入第一个氨基酸，以DCM做溶剂，加入DIEA反应一段时间；2)步骤1)反应结束后DMF洗涤，加入试剂封闭未反应的-OH；3)向步骤2)处理后的树脂中加入哌啶DMF溶液进行脱保护；4)将下一个氨基酸和HOBT的混合物投入至反应器中，加入DIC反应一段时间；5)加入哌啶DMF溶液脱保护，重复上述步骤直至延伸结束，完成多肽粗品的合成；6)向所述的多肽粗品中加入切割液，恒温震荡一段时间，乙醚离心，得到粗产物。作为本专利技术更进一步的改进，所述切割液投加条件为：按照10ml/g的比例向所述多肽粗品中投加。作为本专利技术更进一步的改进，所述步骤1)之前还包括预处理步骤：将所述的二氯树脂首先采用DCM浸泡。该操作目的在于使二氯树脂更加蓬松，暴露更多反应位点。作为本专利技术更进一步的改进，所述封闭未反应的-OH的具体步骤为：首先以DCM溶剂、甲醇和DIEA的混合溶液封闭处理30min，结束后洗涤，再用DCM溶剂、醋酸酐和DIEA的混合溶液封闭处理60min。采用该方式能够使封闭处理更加有效，提高连接效率。作为本专利技术更进一步的改进，所述切割液由TFA、EDT、TIPS和水组成，所述的TFA：EDT：TIPS：水的体积比为95：2：2：1。采用该切割液体系既能够保证氨基酸能够从树脂上有效切割剥离，得到较高的收率。作为本专利技术更进一步的改进，所述步骤4)中的哌啶DMF溶液中哌啶与DMF体积比为1：4。作为本专利技术更进一步的改进，所述步骤1)中加入DIEA反应时间为90min，所述步骤4)中加入DIC后反应的时间为60分钟。作为本专利技术更进一步的改进，所述步骤6)中恒温震荡的时间为240min。作为本专利技术更进一步的改进，所述脱保护的操作具体为：首先使用哌啶DMF溶液脱保护10分钟后，抽干溶液再重新加入哌啶DMF溶液重新脱保护5分钟。采用该脱保护的方式能够保证脱保护完全，保证最终产品的产率。作为本专利技术更进一步的改进，所述脱保护步骤完成后，洗涤、抽干，加入茚三酮、苯酚、吡啶，100℃加热3分钟，显色，该步骤根据显色情况判断是否需要重新投料。该步骤中若溶液显蓝色，或树脂颗粒显蓝色或红褐色，则说明游离氨基还有残留，反之则成功连接。3.有益效果相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术的固相多肽合成Alloferon-2的制备方法，以二氯树脂为固相载体，在多肽延伸的过程中将HOBT+DIC作为反应缩合试剂合成Alloferon-2多肽，得到更高的多肽产率，产率最高达40.46％。本专利技术采用固相合成的方法操作步骤简单，重现性好，成本低，克服了现有技术中采用天然提取方式获取多肽所产生的产率低，难以获取，价格成本高的缺陷。(2)本专利技术的固相多肽合成Alloferon-2的制备方法，在第一个氨基酸连接的过程中，分别投加二氯树脂和第一个氨基酸后，以DCM做溶剂，加入DIEA反应较短的时间(90min)即可完成第一个氨基酸的连接反应，而采用Wang树脂等进行反应时还需要加入更多种类的缩合试剂(DMAP+HOBT+DIC)才能进行反应，且反应时间更长(240min)，因此本专利技术的方法进行第一个氨基酸的连接反应所利用的时间更短，试剂更简单，更容易控制，具有更高的反应效率，同时结合研究，表明在保证反应时间、投料摩尔比和所用的催化剂等影响因素相同时，使用2-Cl树脂的实验组所测算出的连接率最高，因此本专利技术选用二氯树脂配合DIEA作为缩合试剂，不仅具有更高的反应效率，同时能够得到更高的连接成功率。(3)本专利技术的固相多肽合成Alloferon-2的制备方法，利用二氯树脂为固相载体，在多肽延伸阶段采用HOBT+DIC作为缩合试剂，相比多肽延伸阶段采用HOBT+HBTU+DIEA作为催化剂的方式能够得到更高的多肽产率，所采用的缩合试剂更简单，更容易控制，得到的多肽产率更高。附图说明图1为合成多肽的基本结构图；图2为实施例1合成的多肽的液相色谱图；图3为实施例1合成的多肽的质谱图；图4为实施例1合成的多肽的红外光谱图；图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种固相合成Alloferon-2的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：/n1)首先向反应器中投加二氯树脂作为固相载体，而后加入第一个氨基酸，以DCM做溶剂，加入DIEA反应一段时间；/n2)步骤1)反应结束后DMF洗涤，加入试剂封闭未反应的-OH；/n3)向步骤2)处理后的树脂中加入哌啶DMF溶液进行脱保护；/n4)将下一个氨基酸和HOBT的混合物投入至反应器中，加入DIC反应一段时间；/n5)加入哌啶DMF溶液脱保护，重复上述步骤直至延伸结束，完成多肽粗品的合成；/n6)向所述的多肽粗品中加入切割液，恒温震荡一段时间，乙醚离心，得到粗产物。/n

【技术特征摘要】
1.一种固相合成Alloferon-2的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
1)首先向反应器中投加二氯树脂作为固相载体，而后加入第一个氨基酸，以DCM做溶剂，加入DIEA反应一段时间；
2)步骤1)反应结束后DMF洗涤，加入试剂封闭未反应的-OH；
3)向步骤2)处理后的树脂中加入哌啶DMF溶液进行脱保护；
4)将下一个氨基酸和HOBT的混合物投入至反应器中，加入DIC反应一段时间；
5)加入哌啶DMF溶液脱保护，重复上述步骤直至延伸结束，完成多肽粗品的合成；
6)向所述的多肽粗品中加入切割液，恒温震荡一段时间，乙醚离心，得到粗产物。


2.根据权利要求1所述的固相合成Alloferon-2的方法，其特征在于：所述切割液投加条件为：按照10mL/g的比例向所述多肽粗品中投加。


3.根据权利要求1或2所述的固相合成Alloferon-2的方法，其特征在于：所述步骤1)之前还包括预处理步骤：将所述的二氯树脂首先采用DCM浸泡。


4.根据权利要求3所述的固相合成Alloferon-2的方法，其特征在于：所述封闭未反应的-OH的具体步骤为：首先以DCM溶剂、甲醇和DIEA的混合溶液封闭处理30min，结束后洗涤，再用DCM溶剂、醋酸酐和DIEA的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李婉珍，宋平，张伟伟，葛飞，朱龙宝，陶玉贵，
申请(专利权)人：安徽工程大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34