一种嗜酸乳杆菌产细菌素及其分离纯化方法技术

本发明专利技术一方面提供了一种嗜酸乳杆菌产细菌素，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其分子量为1527Da。本发明专利技术另一方面提供了该细菌素的分离纯化方法：步骤一，将该细菌素发酵液依次经过经过陶瓷膜、10kDa超滤膜和1kDa超滤膜过滤过滤处理，对截留液进行真空浓缩，得到细菌素粗提物；步骤二，将细菌素粗提物经过Sephadex G‑25分离收集活性馏分；步骤三，将细菌素活性馏分通过HPLC分离纯化细菌素。本发明专利技术提供的嗜酸乳杆菌产细菌素对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有较好的抑菌效果，且热稳定性好，具有较广谱的抑菌效果和良好的预防腹泻的作用，可在调节动物肠道菌群平衡的应用中发挥重要作用。

A bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus and its separation and purification method

【技术实现步骤摘要】
一种嗜酸乳杆菌产细菌素及其分离纯化方法
本专利技术涉及微生物
，尤其涉及一种嗜酸乳杆菌产细菌素及其分离纯化方法。
技术介绍
肠道菌群是动物肠道功能的重要组成部分，直接影响肠道内营养物质的吸收利用，脂肪酸的合成与代谢，对动物的消化、免疫以及代谢疾病等方面具有重要影响。肠道菌群紊乱或失调会引起动物腹泻，进而对畜牧业造成巨大的经济损失。此前，抗生素被广发应用于治疗动物腹泻，但是抗生素的大量使用及滥用不仅导致了大量耐药性菌株的出现，也破坏了动物肠道的菌群平衡。嗜酸乳杆菌是肠道的主要益生菌之一，属革兰氏阳性菌。它可以产生细菌素、有机酸、过氧化氢等多种天然抑菌物质。其中细菌素是其产生的主要抑菌物质，是一种多肽类抗菌物，具有广泛的用途。细菌素作为天然来源的蛋白类物质，可有效抑制细菌的生长并能够调节动物肠道菌群平衡以此来预防动物腹泻。在食品工业中可以替代部分化学防腐剂，防止食品变质；在饲料工业上可以作为添加剂改善动物的肠道微生物类群；在医药工业上可以调节胃肠道菌群平衡，改善肠道微环境。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供了一种嗜酸乳杆菌产细菌素及其分离纯化方法。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术的第一方面是提供一种嗜酸乳杆菌产细菌素，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。进一步地，嗜酸乳杆菌产细菌素的分子量为1527Da。进一步地，嗜酸乳杆菌产细菌素由嗜酸乳杆菌液态发酵生产。进一步地，该嗜酸乳酸菌为YY13002。r>进一步地，液态发酵过程为：将嗜酸乳杆菌接种于试管斜面MRS琼脂培养基上活化菌种，37℃培养24h；然后将活化好的菌种接种于MRS液体培养基，37℃静止培养16～20h制得种子液；将嗜酸乳杆菌种子液按2％接种量接种到MRS培养基中，37℃静止培养36h，得细菌素发酵液。本专利技术的第二方面是提供该细菌素的分离纯化方法，包括以下步骤：步骤一，将该细菌素发酵液经将该细菌素发酵液经依次经过经过陶瓷膜、10kDa超滤膜和1kDa超滤膜过滤处理，将经上述1kDa超滤膜过滤后的截留液进行真空浓缩，得到细菌素粗提物；步骤二，将步骤一的细菌素粗提物经过SephadexG-25分离收集活性馏分；步骤三，将步骤二得到的细菌素活性馏分通过高效液相色谱法(HPLC)分离纯化细菌素。进一步地，步骤二中的分离步骤为：将细菌素粗提物上样于SephadexG-25，蒸馏水洗脱，流速1.5-3ml/min，根据洗脱峰收集馏分，洗脱1h-3h，收集第一个洗脱峰的活性馏分。进一步地，步骤三采用的色谱柱为RP-C8。进一步地步骤三的流动相包括：A相0.1％TFA水溶液和B相含0.1％TFA的80％乙腈溶液。进一步地，步骤三的洗脱条件为：流速为3-5ml/min，洗脱时间为30-50min。本专利技术采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：本专利技术提供的嗜酸乳杆菌产细菌素对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有较好的抑菌效果，且热稳定性好，具有较广谱的抑菌效果和良好的预防腹泻的作用，可在调节动物肠道菌群平衡的应用中发挥重要作用。此外，本专利技术提供的分离纯化方法操作简单，分离纯度高，可被大规模推广。附图说明图1是本专利技术一实施例中嗜酸乳杆菌产细菌素经过SephadexG-25分离纯化洗脱图；图2是本专利技术一实施例中嗜酸乳杆菌产细菌素HPLC色谱图；图3是本专利技术一实施例中嗜酸乳杆菌产细菌素的MALDI-TOF-MS图；图4是本专利技术一实施例中嗜酸乳杆菌产细菌素对革兰氏阳性和阴性菌的抑菌图(图A为细菌素在不同温度下对大肠杆菌的抑菌图，第一排分别为40℃和70℃，第二排分别为100℃和121℃；图B、C、D和E的第一排分别为细菌素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙氏门菌和产气荚膜梭菌的抑菌图，第二排均为空白对照)。
技术实现思路
本专利技术提供了一种嗜酸乳杆菌产细菌素及其分离纯化方法，下面通过具体实施例对本专利技术进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本专利技术，但是下述实施例并不限制本专利技术范围。实施例1本实施例提供嗜酸乳杆菌产细菌素的筛选方法，包括如下步骤：(1)嗜酸乳杆菌种子液的制备：将嗜酸乳杆菌YY13002接种于试管斜面MRS琼脂培养基上活化菌种，37℃培养24h；然后将活化好的菌种接种于MRS液体培养基，37℃静止培养16～20h制得种子液；(2)嗜酸乳杆菌发酵液的制备：将嗜酸乳杆菌种子液按2％接种量接种到MRS培养基中，37℃静止培养36h，得嗜酸乳杆菌发酵液；(3)细菌素粗提物的制备：将嗜酸乳杆菌发酵液将该细菌素发酵液经依次经过经过陶瓷膜、10kDa超滤膜和1kDa超滤膜过滤处理，将经上述1kDa超滤膜过滤后的截留液进行真空浓缩，即为细菌素粗提物；(4)SephadexG-25纯化：将细菌素粗提物上样于SephadexG-25，蒸馏水洗脱，流速2ml/min，根据洗脱峰收集馏分，洗脱2h，并第一个洗脱峰的活性馏分(图1)；(5)HPLC纯化：将收集到的活性馏分经真空浓缩20倍后，采用RP-C8制备柱(5μL，250×10mm)进行分离纯化，纯化条件：洗脱时间：40min；流速4ml/min；上样量：2ml；检测波长为280nm；洗脱条件如下(其中A为纯水含0.1％TFA，B为80％乙腈含0.1％TFA)：经HPLC纯化后的细菌素见图2，最终得到一个单一的活性峰，将其收集后浓缩20倍，用于质谱鉴定。实施例2本实施例对实施例1获得的嗜酸乳杆菌产细菌素的进行鉴定，鉴定的步骤和结果如下：将经HPLC分离纯化后的活性峰利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱测定其分子量为1527Da(图3)。利用N-端氨基酸测序得到该细菌素的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。实施例3本实施例评估获得的嗜酸乳杆菌产细菌素的抑菌活性。将纯化得到的细菌素分别对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌测定抑菌实验，并用不同温度处理后测定抑菌活性。结果表明(图4)，嗜酸乳杆菌产细菌素对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有较好的抑菌效果，且热稳定性好，具有较广谱的抑菌效果。表1嗜酸乳杆菌产细菌素的抑菌谱以上对本专利技术的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本专利技术并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本专利技术进行的等同修改和替代也都在本专利技术的范畴之中。因此，在不脱离本专利技术的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本专利技术的范围内。序列表<110>上海源耀农业股份有限公司<120>一种嗜酸乳杆菌产细菌素及其分离纯化方法<160>1<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1&l本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种嗜酸乳杆菌产细菌素，其特征在于，所述嗜酸乳杆菌产细菌素的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种嗜酸乳杆菌产细菌素，其特征在于，所述嗜酸乳杆菌产细菌素的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.根据权利要求1所述的嗜酸乳杆菌产细菌素，其特征在于，所述嗜酸乳杆菌产细菌素的分子量为1527Da。


3.根据权利要求1所述的嗜酸乳杆菌产细菌素，其特征在于，所述嗜酸乳杆菌产细菌素由嗜酸乳杆菌液态发酵生产。


4.根据权利要求3所述的嗜酸乳杆菌产细菌素，其特征在于，所述液态发酵过程为：将嗜酸乳杆菌接种于试管斜面MRS琼脂培养基上活化菌种，37℃培养24h；然后将活化好的菌种接种于MRS液体培养基，37℃静止培养16～20h制得种子液；将嗜酸乳杆菌种子液按2％接种量接种到MRS培养基中，37℃静止培养36h，得细菌素发酵液。


5.一种如权利要求1～4任意一项所述的嗜酸乳杆菌产细菌素的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，将该细菌素发酵液经依次经过经过陶瓷膜、10kDa超滤膜和1kDa超滤膜过滤过滤处理，将经上述1kDa超滤膜过滤后的截留...

【专利技术属性】
技术研发人员：李世超，季春源，孙中超，朱校适，
申请(专利权)人：上海源耀农业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31