纯化细菌溶细胞素的方法技术

本发明专利技术涉及用于纯化例如肺炎球菌溶血素的细菌溶细胞素的方法。在去污剂和高盐存在时通过将可溶性凝集的溶细胞素结合到疏水作用层析材料的单个层析步骤产生了优良的溶细胞素的纯化。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及细菌溶细胞素纯化的领域，尤其涉及肺炎球菌溶血素的纯化方法。肺炎球菌溶血素是来自肺炎链球菌的具有良好抗原性特点的蛋白质，其适合作为抗肺炎链球菌传染或中耳炎的疫苗组分。本专利技术的方法描述了以在去污剂和高盐存在时通过将肺炎球菌溶血素结合至疏水作用柱的单个层析步骤纯化肺炎球菌溶血素的不常见的和便利的步骤。该方法方便地利用了细菌溶细胞素尤其在凝集状况下对类似胆固醇的芳香族化合物具有高亲合力而因此通常应用于该毒素家族成员纯化的特性。硫醇活化的溶细胞素形成明显的细菌毒素组，其中链球菌溶血素O为其原型(Billington等.，FEMS Microbiol.Lett.(2000)，182；197-205)。这些毒素通过在细胞膜上形成小孔而溶解真核细胞。氧化剂不利地影响其细胞溶解活性而还原剂可以还原活性。这些组成员的一级氨基酸序列呈现30-60％相似性且在C-末端附近包含几乎不变的十肽以下序列。胆固醇是这些毒素主要的靶细胞受体。溶细胞素结合包含膜和寡聚体的胆固醇以形成上至30nm直径且由40-80个单体亚单位组成的跨膜孔。膜胆固醇的结合引起毒素单体的构象变化而促进寡聚化、膜嵌入和小孔形成的继发事件。肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是一些人类疾病包括肺炎、败血症、脑膜炎、中耳炎和鼻窦炎的病原体。尽管抗生素是有效的有时这些疾病仍可导致死亡。肺炎链球菌抗生素抗性菌株的出现加剧了由该病原体引起的问题。基于此，开发有效的抗肺炎链球菌的疫苗是很重要的。包含纯化的荚膜多糖的多价肺炎球菌疫苗已使用多年。其应用受尤其在包括孕妇、老年人的高风险群体中低的免疫原性以及带来镰形细胞贫血症、多发性骨髓瘤、肝硬化或酒精中毒的限制。其也提供了血清型特定的保护而90个已知的血清型中仅23个由已有制剂覆盖。这将保护在美国人口中所发现血清型的90％而仅保护在亚洲人口中发现血清型的约70％。近来可使用一种缀合的七-价疫苗，其同样具有抗所有肺炎球菌株的问题。肺炎球菌溶血素(Ply)是在所有肺炎链球菌株中发现的53kD硫醇-活化的溶细胞素，其被释放而产生自溶作用且为肺炎链球菌的致病原因。不同血清型的Ply蛋白质间除了有少数氨基酸取代，是非常保守的。肺炎球菌溶血素有高度的保守性和其免疫原性使其成为疫苗组分的可能候选物。然而，野生-型Ply由于其毒性而不适合组合入用于人的疫苗中。Ply通过与膜-结合胆固醇和寡聚体的相互作用而在膜上形成小孔，引起对细胞膜的破坏。在C-末端发现的保守的半胱氨酸-包含基元参与溶解活性。已提示突变Ply而降低其毒性(WO90/06951，WO99/03884)。Lock等描述了肺炎球菌溶血素纯化的二步法(MicrobialPathogenesis(1996)21；71-83)。使用离子交换和凝胶过滤层析的组合从大肠杆菌培养物中纯化重组的肺炎球菌溶血素。该方法包括制备提取物的和流经DEAE Sepharose柱，随后流经Sephacryl S200-HR柱的步骤。该方法可用于纯化重组的或天然的肺炎球菌溶血素。kuo等描述了纯化重组的GST-肺炎球菌溶血素融合蛋白的方法(Infection and Immunity(1995)63；2706-2713)。该融合蛋白在大肠杆菌培养物中表达且细胞裂解物上样于谷胱甘肽琼脂糖凝胶。融合蛋白用谷胱甘肽洗脱而凝血酶可用于裂解该融合蛋白。该蛋白质再一次流经谷胱甘肽-琼脂糖柱以除去GST。亲和纯化的肺炎球菌溶血素进一步用羟基磷灰石柱纯化。Mitchell等(BBA(1989)1007；67-72)描述了利用疏水作用层析纯化肺炎球菌溶血素的方法。在其使用的条件下(250mM盐)，尽管放慢其过程且肺炎球菌溶血素以宽峰被洗脱，肺炎球菌溶血素并没能紧密结合到柱上。需要确定哪个组分包含纯的肺炎球菌溶血素、浓缩阳性组分、重新上柱以及用小体积水洗脱的另外步骤以克服肺炎球菌溶血素没有紧密结合至柱填充材料的问题。仍然保持对改善抗肺炎链球菌疫苗的一贯需求。尽管该蛋白质的毒性仍然是一个问题，Ply组分的结合已经满足该需求。还需要开发用于大批量肺炎球菌溶血素纯化的快速和有效的方法。以前描述的方法包括利用连同介入试验的多个纯化步骤以及浓缩步骤。本专利技术提供了方便地利用了单个层析步骤的更高效的纯化方法，其能用于纯化大批量的肺炎球菌溶血素。附图描述附图说明图1-显示肺炎球菌溶血素纯化的SDS-PAGE凝胶。下列样品上样于SDS-PAGE凝胶-泳道1-分子量标准，泳道2-细胞提取物的上清液，泳道3-流经苯基-琼脂糖凝胶，泳道4苯基琼脂糖凝胶首次洗涤，泳道5-苯基-琼脂糖凝胶二次洗涤，泳道6苯基-琼脂糖凝胶用0.5MNaCl洗涤，泳道7苯基-琼脂糖凝胶用低盐缓冲液洗脱，泳道8经变性/重新折叠步骤后的肺炎球菌溶血素，泳道9-经灭菌过滤后的肺炎球菌溶血素。平板A显示考马斯蓝染色后的凝胶。平板B显示经利用抗-大肠杆菌抗体的蛋白质印迹法探测污染蛋白质后的凝胶。图2-GMBS(N-(γ-马来酰亚胺丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯)修饰的肺炎球菌溶血素-考马斯蓝染色的SDS-PAGE分析。下列样品上样于SDS-PAGE凝胶-泳道1-分子量标准，泳道2-未经修饰的肺炎球菌溶血素，泳道3-用GMBS以GMBS/赖氨酸4/1摩尔比处理的PLY，泳道4-用GMBS以GMBS/赖氨酸4/1摩尔比处理且在37℃孵育7天的PLY，泳道5-用GMBS以GMBS/赖氨酸8/1摩尔比处理的PLY，泳道6-在37℃孵育7天后用GMBS以GMBS/赖氨酸8/1摩尔比处理的PLY，泳道7-用磺基-NHS醋酸盐以NHS/赖氨酸10/1摩尔比处理的PLY，泳道8-用NEM处理的PLY，泳道9-在37℃孵育7天后用NEM处理的PLY。图3-经鼻给予小鼠的GMBS处理的肺炎球菌溶血素毒性。用菱形标记的曲线表示用2μg天然肺炎球菌溶血素攻击的小鼠存活率。用方形标记的曲线表示用10μg GMBS处理的肺炎球菌溶血素攻击的小鼠存活率。图4-用天然肺炎球菌溶血素经鼻攻击的小鼠中通过GMBS处理的肺炎球菌溶血素引发的保护作用。用长方形标记的曲线显示单独用佐剂接种的小鼠存活率。用菱形标记的曲线表示用天然肺炎球菌溶血素接种的小鼠存活率。用方形标记的曲线表示用GMBS处理的肺炎求菌溶血素接种的小鼠存活率。图5-用2型D39肺炎链球菌株经鼻攻击的小鼠中通过PhtD和GMBS处理的肺炎球菌溶血素接种引发的保护作用。用长方形标记的曲线代表单独用佐剂接种的小鼠存活率。用菱形标记的曲线代表用PhtD接种的小鼠存活率。用方形标记的曲线代表用PhtD和GMBS处理的肺炎球菌溶血素接种的小鼠存活率。详细说明方法本专利技术的方法是用于纯化例如肺炎球菌溶血素的细菌溶细胞素的方法。溶细胞素，例如肺炎球菌溶血素，使用仅单个柱层析步骤无需重新装柱而纯化。蛋白质在去污剂和盐存在时以凝集形式结合疏水作用柱。几乎没有蛋白质在该条件下结合柱而使得溶细胞素以单个步骤纯化。对本专利技术的溶细胞素可溶性凝集体而言，优选肺炎球菌溶血素为30,000g离心20分钟后保留在上清液中的溶细胞素的凝集形式。该可溶性凝集体在高盐，优选1M存在时保留在疏水作用层析材料上，优选苯基-琼脂糖凝胶。选择性地，该可溶性凝集本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于细菌溶细胞素纯化的方法，所述方法包括以下步骤：　　　　ａ）培养表达细菌溶细胞素的细胞的培养物；　　　　ｂ）从包含细菌溶细胞素的培养物中制备提取物；　　　　ｃ）在高盐（优选０．６－２Ｍ　　盐）条件下存在去污剂时将包含于提取物中可溶性凝集的细菌溶细胞素结合至疏水作用层析材料；　　　　ｄ）在低盐（优选０－０．２Ｍ盐）条件下存在去污剂时洗脱细菌溶细胞素。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：R比曼斯，C戈拉，E马滕斯，A范德卡门，
申请(专利权)人：葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司，
类型：发明
国别省市：BE[比利时]