纯化方法技术

用于纯化转铁蛋白溶液的方法和纯化方法的产物。用于生产转铁蛋白的方法和生产方法的产物。转铁蛋白在细胞培养物中的用途，作为药物组分，作为药物产物的用途和在细胞培养基中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对序列列表的引用本专利技术包含计算机可读形式的序列列表。计算机可读形式通过提述并入本文。 专利
本专利技术涉及纯化转铁蛋白溶液的方法。本专利技术还涉及的产物。术语“转铁蛋白”指转铁蛋白和转铁蛋白样(transferrin-like)蛋白。
技术介绍
本说明中对在先发表文件的罗列或讨论不应视为承认该文件是本领域当前技术的一部分或者是普通常识。转铁蛋白是已知可调节细胞对铁的生物可用性的蛋白，其支持关键的代谢过程如 DNA合成和氧运输。人血清转铁蛋白(HST)是正常人血清中的主要铁结合蛋白，以约2-4g/ 1 的浓度存在(van Campenhout 等，2003，Free Radic. Res.，37，1069-1077)。血清转铁蛋白目前源自牛或人来源，并且是在商业规模哺乳动物细胞培养中使用的常用补充物。随着管理部门在生物制品生产中降低动物来源组分的压力不断增加，重组转铁蛋白对于无血清、 大规模哺乳动物细胞培养工业是合意的。更具体地，人血清转铁蛋白是678个氨基酸的单体糖蛋白，相对分子量为约 SOkDa0每分子转铁蛋白能够强烈地结合一个或两个铁离子。已经描述了通过层析从血清纯化转铁蛋白，例如在Rivat等(199 Journal of Chromatography, 576 :71-77, US 6, 251, 860 ；US 5，744，586 和 US 5，041，537 中。在 PCT/ EP2008/060482和US 5，986，067中已经描述了从酵母纯化重组转铁蛋白。也可以在其它宿主中，如在植物中产生转铁蛋白。无论何种来源的转铁蛋白，其为动物、人或重组的，理想的是在从所述来源纯化转铁蛋白的过程中回收最大量的转铁蛋白。然而，目前纯化转铁蛋白的方法不能获得足够高的纯化转铁蛋白产量。因此，需要改进的转铁蛋白。专利技术简述本专利技术提供可获得增加的转铁蛋白产量的层析。已经发现的两个步骤特别有益。这两个步骤可以单独或一起使用。因此，本专利技术提供从相对不纯的转铁蛋白溶液中纯化转铁蛋白的改进方法。方法可以包括阴离子层析步骤和阳离子层析步骤中的一个或两个。本专利技术还提供通过纯化的转铁蛋白和通过纯化的转铁蛋白的用途。附图简述附图说明图1显示转铁蛋白溶液中含有(A)O和(B)824mol/摩尔(5. 4mM)硼酸盐时CaptoTMQ 层析的A2Mnm的迹线(trace)，所述溶液加载到层析柱上。图2是宿主细胞蛋白清除率为至少275倍并且回收率至少60%的SP-FF低pH，高盐洗涤2设计空间的覆盖图(overlay plot)图示。专利技术详述本专利技术的第一个方面提供用于纯化转铁蛋白溶液(转铁蛋白溶液可以视为“初始材料”)的方法，所述方法包括a)向相对不纯的转铁蛋白溶液加入四硼酸盐，提供转铁蛋白和四硼酸盐的溶液；b)使转铁蛋白和四硼酸盐的溶液经过转铁蛋白对其没有特异的结合活性的阴离子层析材料，使转铁蛋白与所述材料结合；c)洗涤结合转铁蛋白的层析材料；d)任选地，进一步洗涤结合转铁蛋白的层析材料；和e)任选地，从所述阴离子层析材料回收转铁蛋白。优选地，使用洗涤溶液(其浓度低于步骤(d)的洗涤中使用的洗涤溶液的浓度) 进行步骤(c)的洗涤。例如，“低于”可以指低至少5、10、25、30或50%和/或至少5、10、 20,30,40 或 50mM 或者至少 2、3、4、5 或 10 倍。更具体地，用于纯化转铁蛋白溶液的方法可以包含如下步骤a)向相对不纯的转铁蛋白溶液加入四硼酸盐，以至少1摩尔四硼酸盐对1摩尔转铁蛋白，例如至少20摩尔四硼酸盐对1摩尔转铁蛋白的比例提供转铁蛋白和四硼酸盐的溶液；b)将转铁蛋白和四硼酸盐的溶液施于转铁蛋白对其没有特异的结合亲和性的阴离子层析材料，从而使转铁蛋白与所述材料结合；c)用0. 1至30mM，例如0. l_20mM的四硼酸盐溶液洗涤所述层析材料；d)随后用5至60mM，例如30_60mM或至少30mM的四硼酸盐溶液洗涤层析材料；和e)任选地，从所述阴离子层析材料回收转铁蛋白。术语“没有特异的结合活性”指，优选地，转铁蛋白不以抗体-抗原结合方式与层析材料结合。在将转铁蛋白溶液加载于阴离子层析材料上之前向转铁蛋白溶液加入四硼酸盐的令人惊异的优势是增加了材料对转铁蛋白的加载容量。加载容量可以增加2倍、3 倍或者更多。因此可以在指定量的基质上加载更多的转铁蛋白，和/或可以降低穿透物 (flow-through)中损失的转铁蛋白量。优选地，以1摩尔四硼酸盐对1摩尔转铁蛋白至 1000摩尔四硼酸盐对1摩尔转铁蛋白的比例加入四硼酸盐，例如，以从或高达处于或大约 1、10、15、20、30、50、100、200、300、400、450、500、600、700、800、900 或 1 OOOmo 1/mol 的比例加入。优选的比例是20-1000摩尔四硼酸盐对1摩尔转铁蛋白。在将转铁蛋白加载于阴离子层析材料之前向转铁蛋白加入四硼酸盐的优势可以单独利用或者与上文公开的的洗涤步骤组合。例如，可以使用四硼酸盐单独增加阴离子交换基质的转铁蛋白结合容量，或者与使用该基质的组合来进行。步骤(c)的洗涤中使用的四硼酸盐溶液的浓度可以为处于或大约0. ImM至处于或大约30mM。例如，步骤(c)中使用的四硼酸盐溶液的浓度可为处于或大约0. lmM、0. 5mM、 lmM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、15mM、20mM 或 25mM 至处于或大约 0. 5mM、lmM、2mM、4mM、6mM、 8福、101111、151111、201111、251111或301111。更特别地，(c)的四硼酸盐溶液的浓度可为处于或大约2. 5至处于或大约7. 5mM，最特别为处于或大约5mM。步骤(d)的洗涤中使用的四硼酸盐溶液的浓度可为处于或大约5mM至处于或大约660mM。例如，(d)中使用的四硼酸盐溶液的浓度为处于或大约5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、 30mM、35mM、40mM、45mM、50mM 或 55mM 至处于或大约 10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、 40mM、45mM、50mM、55mM或60mM。更具体地，(d)的四硼酸盐溶液的浓度可为处于或大约20 至处于或大约40mM，最特别地为处于或大约30mM。在更高浓度洗涤，如步骤(d)的洗涤之前，进行低浓度“预洗涤”，如步骤(C)的洗涤的令人惊异的优势，是这种方案可以降低高浓度洗涤过程中转铁蛋白的损失。优选地， “浓度”是“四硼酸盐浓度”。四硼酸盐可以是I族金属的四硼酸盐，如四硼酸钾或四硼酸钠。优选的四硼酸盐是四硼酸钾。可以通过洗脱从阴离子层析材料回收转铁蛋白，例如通过改变pH和/或增加导电性。洗脱溶液的PH可以低于或等于pH 5. 2和/或导电性大于或等于2. 5mS. cm—1。可替换的洗脱液包含IlOmM四硼酸钾或四硼酸钠。优选地，阴离子层析材料包含功能性配体，其为强阴离子交换剂或者弱阴离子交换剂。功能性配体可以是离子。强阴离子交换剂的实例包括季胺基团(”Q”)JP-N+(CH3)3 如 Q Sepharose Fast Flow (Q-FF)禾口 Capto Q(均可从 GE Healthcare, Little 本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．用于纯化转铁蛋白溶液的方法，所述方法包括：ａ）向相对不纯的转铁蛋白溶液中加入四硼酸盐，提供转铁蛋白和四硼酸盐的溶液；ｂ）将所述转铁蛋白和四硼酸盐的溶液施于转铁蛋白对其没有特异的结合活性的阴离子层析材料，从而使转铁蛋白与所述材料结合；ｃ）洗涤结合转铁蛋白的层析材料；ｄ）任选地，进一步洗涤结合转铁蛋白的层析材料；和ｅ）任选地，从阴离子层析材料回收所述转铁蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：LE布拉克威尔，J卡梅伦，PH莫顿，
申请(专利权)人：诺维信生物制药丹麦公司，
类型：发明
国别省市：DK