纯化方法技术

一种纯化淀粉样原纤维的方法，包括用蛋白酶、去污剂、化学变性剂或离液剂对含有原纤维的样品进行处理。随后从处理的样品中收集淀粉样原纤维。处理条件优选只消化、降解或变性样品中的无定形聚集物和可溶性前体，而并不消化、降解或变性淀粉样原纤维。本发明专利技术提供了淀粉样原纤维的同质制剂，其中原纤维包含样品中蛋白质重量的至少８０％。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及原纤维(fibril)的，和基本上不含无定形聚集物及可溶性前体的淀粉样(amyloid)原纤维的制备。
技术介绍
淀粉样原纤维是具有高度组织性的蛋白样聚集物，与阿尔茨海默症或转移性海绵体脑病等病变有关。Tan等，Histopathology 1994，25，403-414。淀粉样原纤维做为一种新的、具有广泛潜在应用价值的纳米结构也正处于研究之中，Lashuel等，Phil Trans R Soc Lond 2001，256，133-46。易于形成淀粉样原纤维的蛋白质可以从缺乏天然蛋白质的致密特征的至少部分折叠或不稳定状态形成淀粉样原纤维。可以形成淀粉样原纤维的蛋白数量稳定增长，说明淀粉样蛋白的形成是一种常见现象，是多肽链的一般特性。牛磷脂酰肌醇-3’-激酶α亚单位的SH3结构域(PI3-SH3)就是一种这样的模式蛋白质。对它的研究使人们对驱动淀粉样原纤维形成的过程及淀粉样原纤维中蛋白链的分子包装细节有了新的认识。PI3-SH3在低pH溶液中形成部分折叠状态，然后慢慢从该状态聚集形成原纤维，该原纤维具有与人类疾病相关的淀粉样原纤维不可区分的结构特征。尽管淀粉样原纤维的结构鉴定方面已取得很大进展，许多问题仍待澄清。对淀粉样原纤维中蛋白链结构特征进行详细定义就是其中的一个问题。其主要困难在于许多淀粉样原纤维样品都存在内在异质性。除此之外，所有体外形成的样品几乎都含有可溶性前体和无定形聚集物。其结果是不能很明确地说明原纤维中蛋白质所采用的结构。因而，将淀粉样原纤维和其它物质相分离的技术的开发对于淀粉样原纤维的研究将极具价值。本文介绍一种从其它成分中纯化淀粉样原纤维的方法。这一方法使我们可以用FTIR法鉴定淀粉样原纤维中具PI3-SH3特征的二极结构组分，避免了可溶性前体和非纤维状聚集物的干扰。 附图说明图1.通过FTIR来监测不同PI3-SH3聚集物对胃蛋白酶消化作用的敏感性。37℃温度下，将主要包含无定形聚集物(pH1.5)或淀粉样原纤维(pH2.0)的样品与胃蛋白酶一起温育，其中胃蛋白酶与PI3-SH3重量比为1∶200。温育的不同时间，从两种样品中取出等分试样来记录FTIR光谱。在含有淀粉样原纤维(pH2.0)的样品中观察到聚集带向高波数位置移动，1684cm-1(单箭头)处的组分减少，而1640cm-1和1660cm-1(双箭头)之间的组分增加。图2.纯化后PI3-SH3淀粉样原纤维的鉴定。(A)纯化前(灰色迹线)和纯化后(黑色迹线)的FTIR光谱。二阶导数光谱显示了各样品中的主要组分。(B)纯化前后淀粉样原纤维的曲线拟合。使用gaussian和lorentzian分量对波谱进行拟合。通过二阶导数分析寻找各组分。尽管通过二阶导数对消化样品进行分析时缺失了1612-1处的一个组分，但在拟合程序之前，人为限定这样一个成分，可以取得较好的拟合度。曲线拟合显示胃蛋白酶消化后1684cm-1和1612cm-1之间的组分显著减少。图3所示为不同变性剂浓度下HEWL淀粉样原纤维中蛋白质的溶解程度。专利技术概述本专利技术利用样品中原纤维与其它非原纤维性杂质之间稳定性的不同，特别是样品中可溶性前体肽和非原纤维性聚集物之间稳定性的不同。本专利技术提供一种纯化淀粉样原纤维样品的方法，包括使用蛋白酶、去污剂、化学变性剂或离液剂对含有原纤维的样品进行处理，并从处理后的样品中收集原纤维。特别是，本专利技术提供一种纯化淀粉样原纤维的方法，其中样品用蛋白酶、去污剂、化学变性剂或离液剂处理，其处理条件使样品中存在的无定形聚集物和可溶性前体得以消化或降解。在本专利技术的一个优选方面中，通过例如对样品加以离心或过滤来收集产生的原纤维，以分离淀粉样原纤维。本专利技术还涉及淀粉样原纤维的纯化的制备物，其中原纤维至少包含样品中蛋白质重量的80％，优选的是至少85％或90％，更优选的是至少95％。专利技术详述本专利技术涉及一种纯化淀粉样原纤维的方法。对淀粉样原纤维样品进行处理，减少原纤维样品中存在的异质。本专利技术特别要去除的是原纤维样品中的可溶性前体肽和非原纤维性聚集物。根据本专利技术，提供一种纯化样品中淀粉样原纤维的方法。本专利技术利用样品中原纤维与其它非原纤维杂质之间的稳定性的不同。特别的是，本专利技术的方法可用于去除样品中的可溶性前体肽和非原纤维性聚集物。优选的是，使用和相应的可溶性前体或非原纤维性聚集物相比，原纤维对其更为稳定的任何试剂对样品进行处理。特别的是，可以用消化或降解可溶性前体和无定形聚集物的试剂，或使聚集物变性的试剂来处理样品，以促进原纤维的分离和纯化。可以用于本专利技术的试剂包括蛋白酶，去污剂，化学变性剂或离液剂，有机溶剂，例如醇(TFE，HFIP，异丙醇)、乙腈、氯仿，在高温或低温下温育样品，以及使用溴化氰之类的化学制剂。所选用的条件应该不促进更多原纤维的形成，以免污染最初的那些原纤维。比如，可以在温育过程对从样品中移出的等分试样进行分析，评价以可溶性前体和非原纤维聚集物形式存在的杂质是否减少，来鉴定适用于各种原纤维样品的试剂。在优选的方面中，本专利技术方法使用蛋白酶、去污剂、化学变性剂或离液剂对样品进行处理。在一个特别优选的实施方案中，提供了能够降解可溶性肽和非原纤维聚集物的蛋白酶或其它试剂，来降解样品中的非原纤维肽，而保持原纤维不受影响。依据本专利技术，提供了一种纯化淀粉样原纤维的方法，该方法包括使用蛋白酶、去污剂、化学变性剂或离液剂对含有原纤维的样品进行处理，并从处理后的样品中收集淀粉样原纤维。待处理的原纤维样品可以通过任何适当的途径获得。原纤维可以是由单个或多个肽前体形成的原纤维，因此可能包含混合原纤维。例如，待纯化样品可以是从体内形成的斑(plaque)中分离的样品。原纤维样品可以从表现出淀粉样沉积的病人或动物的活组织检查和组织样品中获得，淀粉样沉积物含有Aβ、IAPP、运甲状腺素蛋白、β2微珠蛋白、载脂蛋白、AI、凝溶胶蛋白(gelsolin)、溶菌酶、PrP或任何其他淀粉样蛋白源性蛋白之类的多肽。在另一种方案中，待处理样品可以是通过适当的体外方法，从处于导致原纤维形成的条件下的蛋白质样品中制备的样品。例如，原纤维样品可以从上面提到的多肽，或与疾病无关的肽或蛋白质中获得，其方法包括定期调整温度、pH、离子强度、有机溶剂、化学变性剂和螯合试剂等参数，对多肽进行温育，其中在至少部分变性的条件下对蛋白质进行温育，在适当的溶液条件下对小肽进行温育。使用试剂对含有原纤维的样品进行处理，其中和样品中的肽前体、杂质或无定形聚集物相比，原纤维更为稳定。在一个实施方案中，样品用蛋白酶处理。可以使用任何适当的蛋白酶，比如胃蛋白酶之类的蛋白酶。适当蛋白酶的选择，比如，取决于特定pH值及温度条件下待纯化原纤维所表现出的稳定性。胃蛋白酶在低pH值(最适pH值1.8～2.5，20℃～37℃)条件下具有蛋白酶活性。用于相似目的的其他蛋白酶包括胰酶(最适pH值7.5～8.5，20℃～37℃)、链霉蛋白酶(最适pH值6.0～8.0，20℃～40℃)、蛋白酶K(最适pH值7.5～10.5，20℃～37℃)、木瓜蛋白酶(最适pH值6.0～7.5，20℃～37℃)、弹性蛋白酶(最适pH值7.5～8.5，20℃～37℃)、纤维蛋白酶(最适pH值7.5～9.0，20℃～30℃)、纤本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纯化淀粉样原纤维的方法，包括（ａ）用蛋白酶、去污剂、化学变性剂或离液剂处理含有原纤维的样品和（ｂ）从处理后的样品中收集淀粉样原纤维。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：J祖尔多，CM多森，
申请(专利权)人：埃西斯创新有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]