本发明专利技术提供了一种从宿主细胞中纯化病毒的方法，所述方法包括如下步骤：ａ）培养宿主细胞，ｂ）用病毒感染所述宿主细胞，ｃ）用核酸酶处理所述细胞培养物，ｄ）裂解所述宿主细胞以提供包含所述病毒的裂解物。所述病毒优选是重组腺病毒。本发明专利技术还提供了一种纯化重组病毒的方法，所述重组病毒表达一种能结合核酸的异源蛋白质，所述方法包括如下步骤：ａ）培养宿主细胞，ｂ）用所述重组病毒感染所述宿主细胞，ｃ）裂解所述宿主细胞以提供包含所述重组病毒的裂解物，ｄ）将所述重组病毒进行阴离子交换层析和大小排阻层析，其特征在于将含有病毒的混合物用包含至少２Ｍ ＮａＣｌ或者提供相等离子强度的另一种盐的溶液进行至少一次缓冲液更换。
【技术实现步骤摘要】
本申请为于2001年9月25日提交的专利技术名称为"" 的200580005682.4号中国专利技术专利申请的分案申请。 专利
本专利技术属于从宿主细胞中纯化病毒、特别是纯化重组腺病毒的领域。
技术介绍
病毒，无论是天然发生的还是其重组形式的，均可用于疫苗接种 和基因治疗领域。许多病毒或者病毒样颗粒可以安全而有效地在宿主 细胞中增殖(见例如WO 01/38362，其描述了各种病毒在宿主细胞El 永生化的视网膜细胞中的增殖)。重组腺病毒是用于基因治疗和疫苗 接种的一类优选的病毒载体。这些重组腺病毒通常至少在E1区域具 有缺陷，并在提供E1区域的互补细胞(例如293细胞)或者El-永生化 的视网膜细胞如PER.C6W细胞中增殖(见例如美国专利5,994,128)。病毒在宿主细胞中增殖之后，基本上对于所有应用，在进一步应 用之前均需要从宿主细胞中纯化病毒。国际专利申请WO 98/22588描述了生产和纯化腺病毒载体的方 法。所述方法包括培养宿主细胞、用腺病毒感染所述宿主细胞、收获 并裂解宿主细胞、浓縮粗制裂解物、更换所述粗制裂解物的缓冲液、 用核酸酶处理该裂解物、以及使用层析进一步纯化病毒。一些其它出版物描述了从宿主细胞中纯化病毒的方法，大多数注 重使用特异性层析基质从宿主细胞裂解物中纯化病毒，见例如美国专 利6,008,036、 6，586，226、 5,837,520、 6,261,823、 6,537,793和国际专 利申请WO 00/50573、 WO 02/44348和WO 03/078592所述。大多数所述方法应用核酸酶处理步骤降解DNA杂质。尽管一些方法描述了不同的层析基质，但仍需要从宿主细胞培养物中纯化病毒 的替代及优选改良方法。本专利技术提供了这样的方法。附图描述附图说明图1:已知的收获细胞方法(T/B)与本专利技术的方法(B/T)的示意图， 见实施例1所述。T:Triton， B: Benzonase， p. i.:感染后。图2:在T/B及B/T方法(示意图见图l)后澄清除去宿主细胞蛋 白。图中示出了5个单独纯化的处理中样品(in process samples)的 银染SDS-PAGE(4-12% bis-tris NuPAGE, Invitrogen)分析(样品见实施 例1和表1所述)。第2组来自T/B收获方法，其中裂解后加入核酸 酶；第3 —7组来自B/T收获方法，其中核酸酶在裂解之前加入。将 收获物(泳道1)通过0.5pm Clarigard滤膜(泳道2)澄清，随后用 0.8/0.45Sartopore 2滤膜(泳道3)过滤。M:标记物，以kD表示的 Mw在旁边示出。图3:在处理期间用高盐渗滤除去组蛋白(见实施例2)。图中示 出了银染SDS-PAGE。A. 渗透物，样品l:初始渗透物;2:4x浓度之后;3:第l个DFV 0.3 M NaCl; 4:第3个DFV 0.6 M NaCl; 5:第4个DFV 0.6 M NaCl; 6:第5个DFV l.OMNaCl; 7:第6个DFV 1.0 M NaCl; 8:第7个 DFV0.3MNaCl; 9:第9个DFV 0.3M NaCl。 M:标记物，以kD表 示的Mw在旁边示出。B. 渗余物，样品l:起始样品，2:4x浓度之后；3:第l个DFV 0.3 M NaCl; 4:第2个DFV 0,6 M NaCl; 5:第6个DFV 0.6 M NaCl; 6:第7个DFV l.OMNaCl; 7:第8个DFV 1.0 M NaCl; 8:第9个 DFV 0.3 M NaCl; 9:第9个DFV millex (样品8的0.22nm过滤物)。 M:标记物，以kD表示的Mw在旁边示出。图4:本专利技术优选方法的示意图(见实施例1)。图5:从重组病毒制备物中除去埃博拉病毒核蛋白(NP)(见实施 例3实验3.1详述)。图中示出银染SDS-PAGE(4-12%bis-trisNuPAGE, Invitrogen)。 A:起始材料，B:与1% Tween 20温育，C:与2.5 M NaCl 温育。箭头表示NP。图6:从重组病毒制备物中除去埃博拉病毒核蛋白的实验(见实施 例3实验3.3详述)。图7:从重组病毒制备物中除去埃博拉病毒核蛋白(NP)的非还原 SDS-PAGE (第1组)和Western印迹(第2组)分析(见实施例3实验3.3 详述)。泳道A、 B、 C分别含有产物A、 B和C (见图6和实验3.3 所述)。对于Western印迹分析，使用识别NP的抗体。箭头表示NP。图8:从重组病毒中除去埃博拉病毒核蛋白(NP)的RP-HPLC分 析。对产物A、 B和C进行分析。详见实施例3实验3. 3所述。纵轴 是AU(X1(T3)。在横轴(洗脱时间)下，箭头l表示异己酮蛋白的峰， 箭头2表示NP的峰。图9:示出使用高盐和过滤从重组病毒制备物中除去埃博拉病毒 核蛋白的SDS-PAGE (A组)和Western印迹(B组)分析。在阴离子交换 层析后，将样品用含有5M NaCl的溶液进行缓冲液更换。将样品直 接经过0.45nm Millipac 20滤膜(Millipore)过滤。泳道1:过滤之前， 泳道2:过滤之后。对于Western印迹分析，使用识别NP的抗体。箭 头表示NP。图10:加样于Q-XL柱(A组)和带电滤膜(B组)上的Ad35 TFF渗 余物的层析图。B组中的圆圈表示额外的峰，其仅分离自使用带电滤 膜的病毒峰。图11:带电滤膜层析的两种级分的圆盘离心分析。A组示出Ad35 病毒峰的沉降模式图，B组示出额外峰的沉降模式图(图10中的圆形 所示)。图12:层析级分Ad35的SDS-PAGE分析(见实施例6)。 4一12%bis-tris凝胶用银染色。凝胶A示出带电滤膜级分的电泳。1:标记物， 2:起始物，3:流经液，4:峰1 (图10中圆形所示)，5: Ad35峰。 凝胶B示出Q-XL级分的电泳。1:起始物，2:流经液，3: Ad35峰。专利技术描述本专利技术提供了一种从宿主细胞中纯化病毒的方法，所述方法包括如下步骤a)培养感染病毒的宿主细胞，b)向细胞培养物中加入核酸 酶，c)裂解所述宿主细胞以提供包含所述病毒的裂解物。在优选的实 施方案中，所述方法进一步包括d)澄清所述裂解物。在更优选的实 施方案中，所述方法进一步包括e)优选使用至少一个层析步骤进一步纯化所述腺病毒。本专利技术的方法与迄今为止己揭示的方法最重要 的差别是在那些方法中是在细胞裂解之后或者在纯化过程的较晚阶 段加入核酸酶。根据本专利技术，核酸酶是在细胞裂解之前加入。如本发 明所揭示，现在意外地发现这导致优于仅在细胞裂解之后加入核酸酶 的方法的改良。在本专利技术的方法中，与在细胞裂解之后加入核酸酶的 方法相比，得自本专利技术这种方法的纯化的病毒批次含有较少的宿主细胞DNA。在一个优选的实施方案中，所述病毒是重组腺病毒。在一 个实施方案中，步骤b)使用的核酸酶是benzonase 。在一个实施方 案中，裂解宿主细胞的步骤(步骤c)使用去污剂进行，在一个实施方 案中所述去污剂是Triton-X100。在一个实施方案中，裂解物的澄清 (步骤d)包括深层过滤(depth filtration)和膜过滤。在一个优选的实 施本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从重组腺病毒制备物中除去游离腺病毒蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：用含有阴离子交换基团的带电滤膜处理包含游离腺病毒蛋白的重组腺病毒制备物。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：米兰达韦格曼，埃米尔约安内斯约瑟夫斯玛丽亚范考，
申请(专利权)人：克鲁塞尔荷兰公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]
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