纯化方法技术

一种包括阴离子交换层析步骤纯化化脓性链球菌ＧＡＳ糖的方法。该方法提供了良好的ＧＡＳ糖产率。本发明专利技术的糖所含污染的透明质酸、蛋白质和核酸水平低。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及细菌多糖纯化领域，具体是化脓性链球菌(Str印tococcus pyogenes) 多糖的纯化和用于制备疫苗。
技术介绍
多年来已在疫苗中采用了细菌多糖。然而，由于糖是T细胞非依赖性抗原，它们的免疫原性很弱。与载体偶联可将T细胞非依赖性抗原转变成T细胞依赖性抗原，从而增强记忆应答产生保护性免疫力。因此，最有效的糖疫苗基于糖偶联物，原型偶联疫苗是抗b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae) ( ‘Hib，)疫苗。已报导有偶联疫苗的另一种细菌是化脓性链球菌，也称为“A群链球菌”，或简称为 “GAS”。偶联疫苗包含GAS糖，它是细菌细胞壁的一种成分。John Zabriskie及其同事对其已进行了许多研究，例如在参考文献1、2和3中有所讨论。糖基疫苗的起始点是糖本身，通常从目标细菌纯化获得。Zabriskie纯化GAS糖的方法根据参考文献4和5的方法，在参考文献6中有详述。Zabriskie所用的另一种方法与参考文献7的方法类似，在参考文献8和9中有描述。参考文献10中描述了另一种方法。这些方法涉及用还原性酸处理提取GAS糖。具体说，将化脓性链球菌细胞与亚硝酸钠和冰醋酸混合裂解细胞，从而释放GAS糖。然后用分子大小排除层析(如参考文献10中所述)纯化得到的细胞裂解悬液，例如通过凝胶过滤，采用磷酸缓冲盐水作为洗脱液(见参考文献6)，或通过切向流过滤(如文献8)澄清，然后将GAS糖与合适的载体蛋白偶联。文献6和8-10没有说明所用达到的GAS糖产率。另外，虽然参考文献6和 8声称得到的GAS糖制品“所含蛋白和核酸低于(w/w)，，或“无蛋白质和核酸” ， 但没有提到是否除去了蛋白质或核酸以外的杂质。因此，需要进一步改进纯化GAS糖的方法，特别是实现更高产率和纯度的方法。
技术实现思路
本专利技术基于阴离子交换层析纯化糖的方法。专利技术人发现阴离子交换层析提供了良好的GAS糖产率。另外，阴离子交换层析提供了特别纯的GAS糖制品。具体说，本专利技术人发现GAS糖常污染有GAS荚膜多糖的透明质酸。阴离子交换层析对减少GAS糖污染的透明质酸特别有效。当GAS糖用于疫苗时，这具有特别的优点，因为已知透明质酸本身具有免疫原性。因此，透明质酸的存在可能干涉对GAS糖的免疫应答。另外，认为透明质酸会诱导与人组织发生交叉反应的抗体(和)，因此药物产品中存在透明质酸可能对健康有害。阴离子交换层析对减少GAS糖污染的蛋白质和核酸也特别有效。例如另一个优点是，本专利技术人发现GAS糖的纯化应在阴离子交换层析允许糖“流穿”的条件下进行，此时杂质结合于阴离子交换基质，而GAS糖直接流穿此系统进入洗脱液。 采用这些条件简化了纯化过程，因为不需要用流动相缓冲液来提高离子强度或提高PH等从基质上洗脱GAS糖。 专利技术人还发现GAS糖常污染有GAS糖的聚鼠李糖基变体。本专利技术的对减少GAS糖污染的聚鼠李糖特别有效。因此，本专利技术提供一种包括阴离子交换层析步骤的纯化化脓性链球菌 (Streptococcus pyogenes)GAS糖的方法。化脓性链球菌GAS糖悬液中可能含有透明质酸、 链球菌蛋白质和核酸的至少之一种。具体说，本专利技术提供一种分离GAS糖与透明质酸的方法，包括阴离子交换层析步骤。透明质酸通常来自化脓性链球菌荚膜多糖。该方法在阴离子交换层析步骤前后可包括其它纯化步骤。例如，可包括过滤步骤，以除去高分子量污染物 (例如细胞碎片)。类似的，可包括超滤步骤，尤其在所述过滤步骤后，以除去低分子量污染物(例如化脓性链球菌多糖的片段)。还可包括凝胶过滤步骤，以选择特定长度的GAS糖分子，和减少污染，尤其是蛋白质污染。除了凝胶过滤步骤外，或作为替代，本专利技术方法可包括一次或多次浓缩GAS糖的步骤。过滤和/或超滤步骤通常在阴离子交换层析步骤前进行， 而凝胶过滤步骤和/或浓缩步骤通常在阴离子交换层析步骤后进行。随后可用GAS糖制备疫苗。因此，该方法可包括各种处理步骤，例如透析和/或冻干步骤。该方法还可包括将纯化的GAS糖与载体分子偶联的步骤。通常在上述层析步骤之后进行偶联步骤。因此，本专利技术纯化化脓性链球菌(Str印tococcus pyogenes)GAS糖方法的改进，是包括采用阴离子交换层析。阴离子交换层析所得到的GAS糖产率良好，只含有有限量的透明质酸、蛋白质和核酸污染。阴离子层析步骤的产率通常高于70% (例如>75%、>80%、>85%、>90%)。 实际的平均产率上限可能不会超过90% (例如可能< 90%、< 80%,< 75%等)。本专利技术也提供纯化化脓性链球菌GAS糖的方法，该方法提供一种组合物，该组合物所含的污染透明质酸水平低于200ng/ml (例如< 150ng/ml，< 100ng/ml, < 90ng/ml,<80ng/ml, < 75ng/ml, < 60ng/ml, < 50ng/ml, < 40ng/ml, < 25ng/ml, < 20ng/ml,<10ng/ml等)。通常透明质酸污染水平低于lOOng/ml，特别是低于80ng/ml。透明质酸污染的水平也可表示为纯化样品中透明质酸重量与GAS糖重量的相对比例。由此，本专利技术提供纯化化脓性链球菌GAS糖的方法，该方法提供一种组合物，该组合物所含的污染透明质酸水平低于GAS糖重量的5% (例如< 4%，< 3%，< 2%，< 1%，< 0. 75%，< 0. 5%， <0.25%，<0. 等)。通常透明质酸污染水平小于透明质酸与GAS糖的重量比。也可以实现低于此水平，例如等于或低于0. 005%透明质酸重量/GAS糖重量比。本专利技术也提供纯化化脓性链球菌GAS糖的方法，该方法提供一种组合物，该组合物所含的污染性聚鼠李糖水平低于50 % (例如< 40 %，< 30 %，< 25 %，< 20 %，< 15 %，<10%，< 8%，< 6%，< 5%，< 4%，< 2%等)聚鼠李糖重量/GAS糖重量比。通常污染的聚鼠李糖水平低于20 %聚鼠李糖重量/GAS糖重量比。也可获得低于此水平，例如等于或低于5%聚鼠李糖重量/GAS糖重量比。本专利技术还提供纯化化脓性链球菌GAS糖的方法，该方法提供了一种组合物，该组合物所含的污染蛋白质水平低于4.0% (例如< 3. 5%，< 3. 1%，< 3.0%，< 2. 5%， <2. 0%，< 1.5%，< 1.0%，<6%，<5%，<4%，<2%等)蛋白质重量/GAS 糖重量比。通常蛋白质污染水平约 为2%蛋白质重量/GAS糖重量比。本专利技术还提供纯化化脓性链球菌GAS糖的方法，该方法提供一种组合物，该组合物所含的核酸污染水平低于5% (例如< 4%，< 3%，< 2%，< 1%，< 0.75%，<0.5%， <0.25%，<0. 等)核酸重量/GAS糖重量比，。通常核酸污染水平低于以核酸重量 /GA本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种纯化化脓性链球菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ　ＧＡＳ糖的方法，该方法包括阴离子交换层析步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·科斯塔蒂诺，
申请(专利权)人：诺华有限公司，
类型：发明
国别省市：CH