一种固相合成帕瑞肽的制备方法技术

本发明专利技术涉及多肽药物化学合成技术领域，尤其为一种固相合成帕瑞肽的制备方法，包括以下步骤S1，将Fmoc‑Hyp[Boc‑(2‑aminoethyl)carboxyl]‑OH连接到2‑CTC Resin载体上，依照Fmoc固相多肽合成原理和肽序，合成六肽全保护片段H‑Phg‑D‑Trp(Boc)‑Lys(Boc)‑Tyr(Bzl)‑Phe‑Hyp[Boc‑(2‑aminoethyl)carboxyl]‑OH；S2，在液相体系中用缩合试剂将六肽片段进行环化得到环肽片段Cyclo‑[Phg‑D‑Trp(Boc)‑Lys(Boc)‑Tyr(Bzl)‑Phe‑Hyp[Boc‑(2‑aminoethyl)carboxyl]]，设计使用固液相结合的方法合成帕瑞肽，反应条件温和，操作简便，粗品纯度和产率高，消旋少，成本低，环境污染小，适合于工业化生产。

A method of solid phase synthesis of perreotide

【技术实现步骤摘要】
一种固相合成帕瑞肽的制备方法
本专利技术涉及多肽药物化学合成
，具体为一种固相合成帕瑞肽的制备方法。
技术介绍
帕瑞肽(Pasireotide)肽序为：Cyclo-[Phg1-D-Trp2-Lys3-Tyr(Bzl)4-Phe5-Hyp(2-aminoethylcarboxyl)6]，分子式：C58H66N10O9,分子量为1047.23，其结构式如下：帕瑞肽是一种生长抑素(Somatostatin，SST)类似物，通过与生长抑素受体(SSTreceptor，SSTR)结合，主要发挥抑制性生物学作用。该多肽为瑞士诺华制药公司研制生产，2012年4月25日，已获欧洲药品管理署(EMA)下属人用药品委员会(CHMP)批准用于治疗无法手术或手术治疗失败的成人库欣病患者。2015年3月15日，中国国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准诺华公司的门冬氨酸帕瑞肽注射液中国上市，商品名为Signifor(丝尼芬)。目前国内关于帕瑞肽合成的情况大致如下：如专利CN103641894A中报道，制备线性保护肽时使用了侧链没有保护的羟脯氨酸，序列偶联氨基酸时会有酰化的副反应，再用Boc-NH-C2H4-NH-COOH与羟脯氨酸的侧链羟基酯化反应没有方法检测，且酯化不完全会影响帕瑞肽的收率与纯度。在专利CN104447962A中使用Fmoc-Lys-OAll连接到2-CTCResin载体上，合成得到线性肽树脂，环化前脱除OAll需要使用昂贵的四(三苯基磷)钯，操作繁琐且产品容易引人重金属钯，购买特殊氨基酸Fmoc-Lys-OAll，Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH成本高且不易大量获得，不利于规模化生产。综上所述，本专利技术提出一种固相合成帕瑞肽的制备方法来解决存在的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种固相合成帕瑞肽的制备方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种固相合成帕瑞肽的制备方法，包括以下步骤：S1，将Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH连接到2-CTCResin载体上，依照Fmoc固相多肽合成原理和肽序，合成六肽全保护片段H-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH即：首先，称取2-CTCResin(1.04mmol/g)于固相多肽合成反应器中，加入DCM溶涨30min，抽掉，称取Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH并加入约DMF溶解同时冰水浴降温，加入DIPEA活化10min后将氨基酸活化液加入到反应柱中反应，5min后再向反应器中加入DIPEA继续反应约2h。反应结束后，依次加入DMF，MTBE,DMF交替洗涤2遍，将预先配制好的封闭液DCM/MeOH/DIPEA＝17/2/1(V/V/V)倒入树脂中封闭未反应的功能基团，封闭两次，每次10min，封闭结束后，加入DMF洗涤，并用MTBE收缩树脂，转移至真空干燥箱干燥至恒重，取树脂测得取代度为0.719mmol/g，其次，称取Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-O-CTCResin于多肽合成反应器中，加入DCM溶涨30min,抽掉，加入适量5％PIP/2％DBU/1％HOBt/DMF溶液脱保护两次，分别为10min,20min，加入DMF,MTBE,DMF交替洗涤2轮，称取Fmoc-Phe-OH,2.03gHOBt于烧杯中，加入DMF溶解，再加入2.62mLDIPEA在冰水浴条件下降温至0～5℃，最后加入5.69gHBTU活化约10min，将活化液倒入反应器中反应，以茚三酮检测判定缩合是否完全，反应结束后，按照脱保护、洗涤、缩合循环进入下一步氨基酸的缩合,缩合的保护氨基酸依次为：Fmoc-Tyr(Bzl)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-D-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Phg-OH；最后，将上述所得片段(1-6)肽树脂加入到280mL1％TFA/DCM(V/V)溶液中搅拌10min,将滤液抽至含适量吡啶的抽滤瓶中，重复三次，合并滤液并浓缩，将滤液加入到适量纯水中，有白色固体析出，滤除固体并真空干燥至恒重，得固体，测得ESI-MS；S2，在液相体系中用缩合试剂将六肽片段进行环化得到环肽片段Cyclo-[Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]]，即：称取全保护六肽片段于烧瓶中并加入适量THF搅拌至溶解，用DIPEA调pH至中性，称取HOBt于烧杯中，加入THF搅拌至溶解，随后加入DIPEA并用冰水浴降温至-5℃，再加入3.66gHBTU，保持-5℃反应1h后自然回至室温反应3h，可通过TLC或者HPLC监控反应进程，反应结束后，减压旋蒸溶剂THF至20％体积，冷却后挤兑到适量的5％磷酸水溶液中，打浆，过滤，滤饼再用5％磷酸水溶液打浆洗涤2遍，饱和碳酸氢钠水溶液洗涤3遍，水洗涤3遍，正庚烷洗涤1遍，过滤并真空干燥得到白色固体，测得ESI-MS；S3，在液相体系下，用适当比例，浓度TFA/H2O/TIS，条件下酸解脱除环肽片段上Boc保护基，并用冰冻MTBE或乙醚沉降，过滤及干燥得到帕瑞肽粗品Cyclo-[Phg-D-Trp-Lys-Tyr(Bzl)-Phe-Hyp(2-aminoethylcarboxyl)]，即将上述所得全保护环肽Cyclo-[Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]]片段溶于预先冷至0-5℃的100mL95％TFA/2.5％H2O/2.5％TIS溶液中，搅拌至全溶并控制溶液温度不超过15℃，然后将反应升温到25±2℃，搅拌反应30分钟，将切割液加入到冰冻MTBE中，析出固体并过滤，用MTBE洗涤固体3～4遍，将固体转移至真空干燥器中干燥至恒重，称量所得固体重,测得ESI-MS,粗品HPLC纯度，收率。优选的，所述S1，Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH通过DIPEA作用连接到2-CTCResin载体上,且制得Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-CTCResin替代度为0.20mmol/g～1.00mmol/g。优选的，所述S1，合成全保护六肽片段时所使用的保护氨基酸如下：Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Tyr(Bzl)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-D-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Phg-OH，投料摩尔比为1.5～6倍。优选的，所述S1，Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH氨基酸，其由Z-Hyp-OBzl为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种固相合成帕瑞肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1，将Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH连接到2-CTC Resin载体上，依照Fmoc固相多肽合成原理和肽序，合成六肽全保护片段H-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH即：首先，称取2-CTC Resin(1.04mmol/g)于固相多肽合成反应器中，加入DCM溶涨30min，抽掉，称取Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH并加入约DMF溶解同时冰水浴降温，加入DIPEA活化10min后将氨基酸活化液加入到反应柱中反应，5min后再向反应器中加入DIPEA继续反应约2h，反应结束后，依次加入DMF，MTBE,DMF交替洗涤2遍，将预先配制好的封闭液DCM/MeOH/DIPEA＝17/2/1(V/V/V)倒入树脂中封闭未反应的功能基团，封闭两次，每次10min，封闭结束后，加入DMF洗涤，并用MTBE收缩树脂，转移至真空干燥箱干燥至恒重，取树脂测得取代度为0.719mmol/g，其次，称取Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-O-CTC Resin于多肽合成反应器中，加入DCM溶涨30min,抽掉，加入适量5％PIP/2％DBU/1％HOBt/DMF溶液脱保护两次，分别为10min,20min，加入DMF,MeOH,DMF交替洗涤2轮，称取Fmoc-Phe-OH,2.03gHOBt于烧杯中，加入DMF溶解，再加入2.62mLDIPEA在冰水浴条件下降温至0～5℃，最后加入5.69gHBTU活化约10min，将活化液倒入反应器中反应，以茚三酮检测判定缩合是否完全，反应结束后，按照脱保护、洗涤、缩合循环进入下一步氨基酸的缩合,缩合的保护氨基酸依次为：Fmoc-Tyr(Bzl)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-D-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Phg-OH；最后，将上述所得片段(1-6)肽树脂加入到280mL1％TFA/DCM(V/V)溶液中搅拌10min,将滤液抽至含适量吡啶的抽滤瓶中，重复三次，合并滤液并浓缩，将滤液加入到适量纯水中，有白色固体析出，滤除固体并真空干燥至恒重，得固体，测得ESI-MS；/nS2，在液相体系中用缩合试剂将六肽片段进行环化得到环肽片段Cyclo-[Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]]，即：称取全保护六肽片段于烧瓶中并加入适量THF搅拌至溶解，用DIPEA调pH至中性，称取HOBt于烧杯中，加入THF搅拌至溶解，随后加入DIPEA并用冰水浴降温至-5℃，再加入3.66gHBTU，保持-5℃反应1h后自然回至室温反应3h，可通过TLC或者HPLC监控反应进程，反应结束后，减压旋蒸溶剂THF至20％体积，冷却后挤兑到适量的5％磷酸水溶液中，打浆，过滤，滤饼再用5％磷酸水溶液打浆洗涤2遍，饱和碳酸氢钠水溶液洗涤3遍，水洗涤3遍，正庚烷洗涤1遍，过滤并真空干燥得到白色固体，测得ESI-MS；/nS3，在液相体系下，用适当比例，浓度TFA/H2O/TIS，条件下酸解脱除环肽片段上Boc保护基，并用冰冻MTBE或乙醚沉降，过滤及干燥得到帕瑞肽粗品Cyclo-[Phg-D-Trp-Lys-Tyr(Bzl)-Phe-Hyp(2-aminoethylcarboxyl)]，即将上述所得全保护环肽Cyclo-[Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxy l]]片段溶于预先冷至0-5℃的100mL95％TFA/2.5％H2O/2.5％TIS溶液中，搅拌至全溶并控制溶液温度不超过15℃，然后将反应升温到25±2℃，搅拌反应30分钟，将切割液加入到冰冻MTBE中，析出固体并过滤，用MTBE洗涤固体3～4遍，将固体转移至真空干燥器中干燥至恒重，称量所得固体重,测得ESI-MS,粗品HPLC纯度，收率。/n...

【技术特征摘要】
1.一种固相合成帕瑞肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，将Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH连接到2-CTCResin载体上，依照Fmoc固相多肽合成原理和肽序，合成六肽全保护片段H-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH即：首先，称取2-CTCResin(1.04mmol/g)于固相多肽合成反应器中，加入DCM溶涨30min，抽掉，称取Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-OH并加入约DMF溶解同时冰水浴降温，加入DIPEA活化10min后将氨基酸活化液加入到反应柱中反应，5min后再向反应器中加入DIPEA继续反应约2h，反应结束后，依次加入DMF，MTBE,DMF交替洗涤2遍，将预先配制好的封闭液DCM/MeOH/DIPEA＝17/2/1(V/V/V)倒入树脂中封闭未反应的功能基团，封闭两次，每次10min，封闭结束后，加入DMF洗涤，并用MTBE收缩树脂，转移至真空干燥箱干燥至恒重，取树脂测得取代度为0.719mmol/g，其次，称取Fmoc-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]-O-CTCResin于多肽合成反应器中，加入DCM溶涨30min,抽掉，加入适量5％PIP/2％DBU/1％HOBt/DMF溶液脱保护两次，分别为10min,20min，加入DMF,MeOH,DMF交替洗涤2轮，称取Fmoc-Phe-OH,2.03gHOBt于烧杯中，加入DMF溶解，再加入2.62mLDIPEA在冰水浴条件下降温至0～5℃，最后加入5.69gHBTU活化约10min，将活化液倒入反应器中反应，以茚三酮检测判定缩合是否完全，反应结束后，按照脱保护、洗涤、缩合循环进入下一步氨基酸的缩合,缩合的保护氨基酸依次为：Fmoc-Tyr(Bzl)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-D-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Phg-OH；最后，将上述所得片段(1-6)肽树脂加入到280mL1％TFA/DCM(V/V)溶液中搅拌10min,将滤液抽至含适量吡啶的抽滤瓶中，重复三次，合并滤液并浓缩，将滤液加入到适量纯水中，有白色固体析出，滤除固体并真空干燥至恒重，得固体，测得ESI-MS；
S2，在液相体系中用缩合试剂将六肽片段进行环化得到环肽片段Cyclo-[Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-Hyp[Boc-(2-aminoethyl)carboxyl]]，即：称取全保护六肽片段于烧瓶中并加入适量THF搅拌至溶解，用DIPEA调pH至中性，称取HOBt于烧杯中，加入THF搅拌至溶解，随后加入DIPEA并用冰水浴降温至-5℃，再加入3.66gHBTU，保持-5℃反应1h后自然回至室温反应3h，可通过TLC或者HPLC监控反应进程，反应结束后，减压旋蒸溶剂THF至20％体积，冷却后挤兑到适量的5％磷酸水溶液中，打浆，过滤，滤...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐大平，张国庆，白俊才，
申请(专利权)人：上海昂博生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31