免疫调节肽在制备免疫增强类药物上的应用制造技术

本发明专利技术公开了免疫调节肽在制备免疫增强类药物上的应用，该类多肽发现于人母乳β‑酪蛋白，不超过21个氨基酸，能进入细胞并分布于细胞质和细胞核中。该类多肽对人单核细胞细胞增殖活力和细胞凋亡无显著影响，离体实验证明能显著促进人单核细胞的迁移，从而提高机体的免疫应答机制。该类多肽能促进人MCP‑1、MCP‑3及TNFα的表达，显著提高人p‑IκBα的表达，可激活NF‑κB信号通路。

Application of immunoregulatory peptide in the preparation of Immunoenhancers

【技术实现步骤摘要】
免疫调节肽在制备免疫增强类药物上的应用
本专利技术涉及生物来源多肽的新应用，具体地说涉及免疫调节肽在制备免疫增强类药物上的应用。
技术介绍
抗生素的发现是现代医学最为伟大的成就之一，但是随着抗生素的广泛使用，许多微生物对常见的抗生素产生了耐药性，多重耐药菌引发的感染已经逐渐成为医疗领域长期面临的挑战，因此，新型抗菌制剂的研发迫在眉睫。近年来，多肽治疗被越来越多的应用于临床，具有抗微生物等多种生物学功能的抗菌肽也被研发，但是，针对杀伤病原菌的药物仍有产生耐药性的风险。先天性免疫应答是抵抗病原微生物的第一道防线。因此，调节先天性免疫系统功能这种抗感染治疗的新途径，逐渐受到人们的关注。调节免疫系统功能不仅具有与抗生素治疗类似的效果，还有更广泛的潜在应用价值，能够有效减少，甚至避免耐药性的问题。许多已知的具有免疫增强活性的多肽作为已建立的治疗模式的可行的佐剂的成功使用，为未来几十年里感染和其他恶性疾病的治疗提供了崭新的思路。自1974年，一种最小的细菌肽聚糖碎片胞壁酰二肽(MuramylDipeptide，MDP)被发现具有免疫刺激活性，研究者都在努力研发化学成分确定、低分子量的物质的免疫增强剂。因此，许多强有力的化合物逐渐被发掘，它们中的一些目前已进入临床试验阶段。新型的、化学成分明确，可用于临床的免疫调节剂，例如许多结构上与MDP相似的糖肽和脂肽已经被设计和合成。但是，它们大多数都包含微生物来源的成分，因此具有一定的毒副作用。母乳作为新生儿天然的营养来源，在体内蛋白酶的水解作用下会产生大量的内源性多肽，这些多肽不仅为新生儿提供氨基酸来源，还发挥着多种生物学功能，保护新生儿免受感染。我们借助超滤技术从人的母乳中分离出小于10kDa的多肽混合物，进一步借助串联质谱技术(LC-MS/MS)对多肽混合物的具体成分进行鉴定分析。结果发现，这些多肽主要是从人母乳β-酪蛋白(Homosapiensβ-casein，基因Bank号：NM_001891)中断裂下来的片段，天然存在于母乳中。经生物信息学分析，我们从鉴定的多肽片段中筛选出一条具有潜在免疫增强作用的多肽，并对其进行深入的研究。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术的目的是提供了一类发现于人母乳β-酪蛋白的多肽的新应用，其可用于制备免疫增强类或免疫调节类药物；本专利技术还有一个目的是保护含有这一类多肽的组合物。技术方案：本专利技术所述的免疫调节肽的通式如下：R1-A-P-B-R2其中，P为SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；R1选自氨基、乙酰基的任意一种；R2选自羟基、氨基的任意一种；A为0～5个氨基酸组成的肽链；B为0～5个氨基酸组成的肽链。本专利技术所述的免疫调节肽包括但不限于SEQIDNO.1所示的序列，以前述序列作为共同的连续多肽链，同源性超过66.67％的多肽都具有一定的免疫增强或免疫调节用途，如以下几个氨基酸序列：SEQIDNO.2：VLKSPTIPFFDPQIPKSEQIDNO.3：MPVLKSPTIPFFDPQIPSEQIDNO.4：MPVLKSPTIPFFDPQIPKSEQIDNO.5：GRVMPVLKSPTIPFFDPQIP以上多肽都发现于人母乳β-酪蛋白第112-132位氨基酸，可以通过化学合成(液相法和固相法)、生物制备(原核表达系统和真核表达系统)等方法制备获得，并可通过将肽链氮端进行乙酰化，肽链碳端进行酰胺化修饰，以增强其稳定性。其中，SEQIDNO.5所示的免疫调节肽相对于其余多肽具备更好的活性。该多肽分子量(Mw)为2238.2，等电点(pI)为8.8，脂肪指数为87.5，亲水性0.17，90％的氨基酸以无规卷曲，10％的氨基酸以延伸链的二级结构存在。本专利技术所述的免疫调节肽加入人单核细胞系THP-1中处理3小时后，将细胞用甩片机甩片后用4％多聚甲醛固定细胞，并滴加含有DAPI染料的抗淬灭剂，封片，采用共聚焦显微镜拍照。结果显示该多肽能够进入细胞并分布于细胞质和细胞核中。通过离体细胞增殖活力的测定，本专利技术所述的免疫调节肽对人单核细胞增殖活力无显著影响，经流式检测结果显示，多肽对人单核细胞细胞凋亡无显著影响。经Transwell体外细胞迁移实验发现，所述免疫调节肽可显著促进人单核细胞的迁移。实时荧光定量PCR结果显示，所述免疫调节肽能显著促进人单核细胞趋化因子MCP-1、MCP-3以及细胞因子TNFα的表达。众所周知，病原体感染的有效控制和清除取决于单核细胞向感染部位的迁移。这种迁移依赖于趋化因子的环境，包括单核细胞趋化蛋白1和3(MCP-1和MCP-3)。活性单核细胞产生的细胞因子，如TNFα可以对多种病原体产生有效的防御性炎症反应。本专利技术还通过蛋白免疫印迹试验，发现所述免疫调节肽能显著增加人单核细胞中磷酸化IκBα的表达，表明能够激活NF-κB信号通路。先天性免疫信号网络响应各种刺激而呈现出振荡动态。NF-κB信号通路是控制单核细胞趋化因子和炎性细胞因子表达的重要通路之一。传统抗生素以及抗菌肽是直接作用于菌体细胞DNA、RNA和蛋白质合成系统的特定环节实现杀菌作用，容易产生耐药性。与直接杀伤病原相比，通过主动调节免疫系统中免疫细胞的功能、增强其清除病原的能力，可以更加有效地避免耐药性的产生，因此具有更大的应用前景。先天性免疫是免疫系统的第一道防线，单核细胞是先天性免疫应答的关键效应细胞，更是先天性免疫和适应性免疫之间的重要纽带。因此，增强先天性免疫细胞单核细胞的功能将有助于病原的清除。现有的免疫增强活性的多肽如MDP其作用靶点多为抗原提呈细胞如树突状细胞，可通过TLR4/NFκB信号通路促进树突状细胞成熟，诱导树突状细胞产生细胞因子IL-12和TNFα，增强树突状细胞的抗原递呈能力。但是MDP包含微生物来源的成分，具有一定的毒副作用。本专利技术所述的多肽来源于人母乳的天然成分β-酪蛋白，多肽序列及理化性质与上述免疫增强多肽完全不同。本专利技术所述的多肽能够顺利进入人单核细胞中，并对人单核细胞的增殖活力和凋亡没有显著影响，但能够明显增强单核细胞的迁移能力，促进单核细胞趋化因子MCP-1、MCP-3和细胞因子TNFα的表达，并能够激活NFκB信号通路。因此，本专利技术所述的多肽具有良好的免疫增强效果，安全性优。本专利技术所述的这五个免疫调节肽，可选用任意不同的两个或多个配制成组合物，用于制备免疫增强类药物或免疫调节类药物。附图说明图1是基于I-TASSER数据库预测本专利技术所述多肽的空间结构示意图；图2是试验例1多肽入胞的荧光显微镜拍照；图3是试验例2测定多肽对人单核细胞增殖活力影响的对照曲线图；图4是试验例3测定多肽对人单核细胞凋亡影响的对照流式散点图；图5是试验例4中多肽促进人单核细胞迁移的显微镜下染色对照图以及计数统计结果的对照柱形图；图6是试验例5中多肽促进人单核细胞MCP-1、MCP-3、TNF-α表达的对照柱形图；图7是试验例6中五本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.免疫调节肽在制备免疫增强类药物上的应用。/n

【技术特征摘要】
1.免疫调节肽在制备免疫增强类药物上的应用。


2.免疫调节肽在制备免疫调节类药物上的应用。


3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述免疫调节肽的通式如下：
R1-A-P-B-R2
其中，P为SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；
R1选自氨基、乙酰基的任意一种；
R2选自羟基、氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹彦，季晨博，崔县伟，
申请(专利权)人：南京市妇幼保健院，
类型：发明
国别省市：江苏;32