唾液酸寡糖-量子点缀合物、其制备方法及用途技术

本发明专利技术涉及一种唾液酸寡糖‑量子点缀合物、其制备方法及其在病毒检测方面的用途。本发明专利技术的唾液酸寡糖‑量子点缀合物为通过模块化制备方法来制备；借助唾液酸寡糖对病毒或其表面蛋白进行特异性识别，进而通过量子点与金纳米粒子间的能量共振转移实现信号的转化和放大。

Sialic acid oligosaccharide quantum embellishment complex, its preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
唾液酸寡糖-量子点缀合物、其制备方法及用途
本专利技术涉及生物材料领域，具体涉及唾液酸寡糖-量子点缀合物及其制备方法，以及该缀合物在病毒检测方面的用途。
技术介绍
流行性感冒(流感)是由流感病毒引起的人畜共患传染病，它的宿主涉及人、猪、鸟、马和海豚等多种动物。研究证实，流感病毒表面的糖蛋白血凝素(hemagglutinin，HA)能够特异识别宿主细胞表面的糖链受体，这是流感病毒感染宿主、进而复制并继续传播的生物学基础。对多种宿主而言，某些流感病毒变体具有高致病性和/或高死亡率，严重威胁动物和人类的健康。因此，本领域存在对流感病毒进行快速准确的检测的需求。目前，检测流感病毒的方法越来越多样化。其中常见的包括病原学检测、免疫学检测、分子生物学检测以及生物芯片技术检测。病原学检测是最严谨、最经典的方法；然而，传统的流感病毒分离培养过程需要一到两周，其操作繁琐、周期较长且安全性低。免疫学方法操作简单且能够快速得到结果，已经成为应用最为广泛的流感病毒检测方法之一。其中，血凝测试和血凝抑制测试虽然原理简单且能够鉴别亚型，但是灵敏度不高，不能直接用来检测病毒浓度低的样品。神经氨酸酶抑制测试可以对流感病毒进行检测并对其NA亚型进行鉴别，但该方法操作步骤繁琐，影响因素较多。病毒中和测试在病毒的检测鉴定中运用广泛，其灵敏度和特异性均较高，然而该方法操作繁琐且耗时较长，不适合在临床常规检测中使用。琼脂糖凝胶扩散测试可以对流感病毒的抗原或者感染流感病毒后产生的血清抗体进行检测，进而分析流感病毒的亚型，然而该方法耗时长，且实验结果难于量化。酶联免疫吸附试验操作简单、特异性强、诊断快速，但是不能分析流感病毒的受体特异性。分子生物学检测方法相对简单、易操作、能够快速诊断。其中，聚合酶链反应具有非常高的灵敏度，然而容易出现假阳性结果。实时荧光定量PCR可以同时实现多种亚型流感病毒的检测，但是操作繁琐，且需要使用昂贵的试剂和仪器，不适用于对待测样品的大规模初筛。生物芯片技术具有较高通量，可以在较短时间内同时对多个样品进行准确的检测和分析，但由于芯片价格昂贵且实验条件要求高，目前该技术并没有得到广泛的应用。近年来发展的纳米技术为生物检测提供了新的可能。已经发现包括金纳米材料、铂纳米材料、磁性纳米材料和量子点等在内的各种新材料各自具有独特的理化性质。其中，相对于传统有机荧光染料，量子点具有荧光强度高、不易淬灭等优点，因而使用量子点所建的检测体系具有很好的稳定性以及较高的灵敏度。在本专利技术中，考虑到流感病毒表面的血凝素(HA)可以特异性识别和结合不同的唾液酸寡糖受体，将合成的唾液酸寡糖分别修饰至量子点和金纳米粒子，能够通过荧光共振能量转移(FRET)来对待测样品中的流感病毒进行定性和/或定量检测。
技术实现思路
在第一方面，本专利技术提供了一种唾液酸寡糖-量子点缀合物，该缀合物具有式X-I的结构：其中，在式X-I中，QD为量子点；m为300-600的整数；n为0-12的整数；所述选自于由如下的基团所组成的组：在式X-II和式X-III中，R1为羟基或乙酰胺基，R2为羟基或L-岩藻糖基，R3为羟基或硫酸酯基，x为1-3的整数。在第二方面，本专利技术提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含第一方面所述的唾液酸寡糖-量子点缀合物，并优选进一步包含唾液酸寡糖-金纳米粒子。在第三方面，本专利技术提供了制备如第一方面所述的唾液酸寡糖-量子点缀合物的方法，所述方法包括如下步骤：(1)使式M-I所示的化合物与硫辛酸反应，得到式M-II所示的化合物；N3CH2(CH2OCH2)nCH2NH2式M-I；(2)通过点击化学反应将式M-IIII所示的化合物连接至步骤(1)获得的式M-II所示的化合物，得到式M-IV所示的化合物：(3)对步骤(2)获得的式M-IV所示的化合物中的羟基进行脱保护，得到式M-V所示的化合物：(4)对步骤(3)获得的式M-V所示的化合物的末端进行唾液酸化，得到式M-VI所示的化合物：(5)对步骤(4)获得的式M-VI所示的化合物进行活化，得到式M-VII所示的化合物：(6)将步骤(5)获得的式M-VII所示的化合物连接至量子点的表面，得到式X-I所示的唾液酸寡糖-量子点缀合物：在式M-I、式M-II、式M-III、式M-IV、式M-V、式M-VI、式M-VII和式X-I中，n为0-12的整数；在式X-I中，m为300-600的整数，QD为量子点；在式M-VI、式M-VII和式X-I中，所述选自于由如下的基团所组成的组：在式X-II和式X-III中，R1为羟基或乙酰胺基，R2为羟基或L-岩藻糖基，R3为羟基或硫酸酯基，x为1-3的整数。在第四方面，本专利技术提供了第一方面所述的唾液酸寡糖-量子点缀合物或第二方面所述的试剂盒在对样品中的病毒或病毒蛋白进行检测方面的用途。在第五方面，本专利技术提供了一种对样品中的病毒进行检测的方法，所述方法包括：(i)将本专利技术的唾液酸寡糖-量子点缀合物、唾液酸寡糖-金纳米粒子与样品进行孵育；以及(ii)在步骤(i)的孵育后对所述样品的FRET信号进行检测。附图说明图1为根据本专利技术一个实施方式的原理图。表面修饰有唾液酸寡糖的量子点以及表面修饰有唾液酸寡糖的纳米金粒子被激发后具有各自的特征出射谱。当体系中存在流感病毒时，由于唾液酸寡糖与流感病毒的结合，量子点与纳米金粒子在空间上接近，从而在量子点与纳米金粒子间存在荧光共振能量转移，在量子点的激发波长下，量子点的出射光强度与体系中流感病毒的浓度负相关。图2为商购的油溶性量子点(a)以及根据制备例3制备的3’SLac-量子点(b)的TEM图。图3为在本专利技术实施例1的实验体系下，游离的3’SLac-金纳米粒子和3’SLac-量子点的TEM图像(a)以及在加入H7蛋白后，3’SLac-金纳米粒子和3’SLac-量子点发生聚集的TEM图像(b)。图4示出游离的量子点以及根据本专利技术制备例3制备的3’SLac-量子点的红外吸收光谱。图5示出游离的量子点以及根据本专利技术制备例3制备的3’SLac-量子点的核磁共振一维氢谱(NMR)。图6为通过热失重(TGA)曲线进行分析，量子点上被修饰的唾液酸寡糖的量。图7为不同浓度的3’SLac-量子点和3’SLac-金纳米粒子检测体系的检测结果。图8为根据实施例1，对不同浓度的H7蛋白进行检测的结果。图9为根据实施例2，对不同浓度的H5N1流感病毒进行检测的结果。图10为根据实施例3，对不同浓度的H1N1流感病毒进行检测的结果。具体实施方式流感病毒对宿主唾液酸的识别和结合有偏好型。例如，禽流感病毒倾向于结合唾液酸α2,3Gal受体(Siaα2,3Gal，存在于例如禽类的肠道)，而人流感病毒则主要结合唾液酸α2,6Gal受体(Siaα2,6本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种唾液酸寡糖-量子点缀合物，该缀合物具有式X-I的结构：/n

【技术特征摘要】
1.一种唾液酸寡糖-量子点缀合物，该缀合物具有式X-I的结构：



其中，在式X-I中，QD为量子点；m为300-600的整数；n为0-12的整数；
所述选自于由如下的基团所组成的组：



在式X-II和式X-III中，R1为羟基或乙酰胺基，R2为羟基或L-岩藻糖基，R3为羟基或硫酸酯基，x为1-3的整数。


2.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1所述的唾液酸寡糖-量子点缀合物，并优选进一步包含唾液酸寡糖-金纳米粒子。


3.制备如权利要求1所述的唾液酸寡糖-量子点缀合物的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)使式M-I所示的化合物与硫辛酸反应，得到式M-II所示的化合物；
N3CH2(CH2OCH2)nCH2NH2式M-I；



(2)通过点击化学反应将式M-III所示的化合物连接至步骤(1)获得的式M-II所示的化合物，得到式M-IV所示的化合物：



(3)对步骤(2)获得的式M-IV所示的化合物中的羟基进行脱保护，得到式M-V所示的化合物：



(4)对步骤(3)获得的式M-V所示的化合物的末端进行唾液酸化，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李学兵，张振兴，祁晓晓，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11