戊唑醇半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了戊唑醇半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用，本发明专利技术提供的戊唑醇半抗原既最大程度保留了戊唑醇的特征结构，使得戊唑醇半抗原的免疫原性明显增强，又具有可以与载体蛋白发生偶联的羧基；用戊唑醇半抗原与载体蛋白偶联后得到的戊唑醇免疫抗原去免疫动物，更有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体，经检测戊唑醇抗体的灵敏度可达0.05μg/L，与其他农药的交叉反应率低，为后续建立戊唑醇的各种免疫分析方法提供了基础。

Preparation and application of Tebuconazole hapten, artificial antigen and antibody

【技术实现步骤摘要】
戊唑醇半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
本专利技术属于食品安全检测领域。更具体地，本专利技术涉及戊唑醇半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
戊唑醇是高效广谱的内吸性三唑类杀菌剂，杀菌谱广、内吸性强、持效期长，具有保护、治疗作用。戊唑醇被植物吸收后，在植物组织中向顶转移，能防治各种作物中的多种病菌，目前主要应用在控制禾谷类及花生病害、香蕉叶斑病、油菜白粉病和茶饼病等病害。但戊唑醇对哺乳动物具有毒性，且在肝脏和血液中有毒性蓄积作用，具有潜在的非遗传致癌毒性作用及环境激素内分泌干扰效应。美国环保署已将三唑类杀菌剂中的戊唑醇、烯效唑、己唑醇、丙环唑和氟环唑列入潜在的人类致癌物名单，我国也规定了部分农作物和蔬菜中戊唑醇的最大残留限量。目前，国内外检测戊唑醇主要有气相色谱法、高效液相色谱法和气相色谱质谱法等分析方法。仪器检测法存在样品前处理繁琐、检测时间长、仪器贵重等缺点，所以在我国无法得到广泛应用，并且不符合现场检测“在短时间内低成本对大量样品进行准确检测和筛选”的要求。而免疫学检测分析技术以其高灵敏、特异性高、快速、操作简便等优点在药物残留检测领域已被广泛应用，比起仪器等检验方法有很多优势。所以免疫分析为戊唑醇残留研究提供了一条新的分析检测方法。在建立免疫学检测方法并应用该检测方法检测戊唑醇残留量时，关键技术在于能够获取到特异性强、灵敏度高的抗体，而要实现这一目标，前提条件就是得合成、制备出合适的戊唑醇半抗原。
技术实现思路
针对现有技术中存在的不足之处，本专利技术提供一种能最大程度保留戊唑醇的特征结构，又具有一定长度连接臂的半抗原以及这种半抗原的制备方法；以此半抗原制备的人工抗原、检测灵敏度高和特异性强的抗体；以及此半抗原的应用。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：本专利技术的第一个目的是提供一种戊唑醇半抗原，其具有如下结构式：本专利技术的第二个目的是提供一种戊唑醇半抗原的制备方法，其是由戊唑醇与丁二酰氯反应得到。进一步地，该制备方法为：取戊唑醇加无水二氯甲烷溶解，加三氯化铝，充分搅拌后，加入丁二酰氯，室温搅拌反应12h，反应完毕后，进行分离纯化后得到戊唑醇半抗原；其中，所述戊唑醇、三氯化铝和丁二酰氯的物质的量之比为1:(4-5):(1-2)。进一步地，该制备方法的具体步骤如下：取戊唑醇0.307g加无水二氯甲烷80mL溶解，加三氯化铝0.57g，充分搅拌后，加入丁二酰氯0.16g，室温搅拌反应12h，反应完毕后，加水70mL振荡、静置，去除水相，旋蒸蒸干，上硅胶柱，用体积比为1:1的石油醚-乙酸乙酯洗脱分离，得到戊唑醇半抗原。本专利技术的第三个目的是提供一种戊唑醇人工抗原，所述戊唑醇人工抗原包括戊唑醇免疫抗原和戊唑醇包被抗原，所述戊唑醇人工抗原是载体蛋白和上述戊唑醇半抗原偶联得到的偶联物。进一步地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白。本专利技术的第四个目的是提供一种戊唑醇人工抗原的制备方法，其中所述戊唑醇免疫抗原的制备包括如下步骤：将50mg牛血清白蛋白用0.05mol/LPB缓冲液溶解，得到蛋白A液；将15mg戊唑醇半抗原用1mLN,N-二甲基甲酰胺溶解，加入11mg碳二亚胺、9.7mgN-羟基琥珀酰亚胺，吹打混匀，室温反应2h，然后滴加到上述蛋白A液中，反应2h，用0.02mol/LPBS缓冲液透析纯化3天，分装冻存；所述戊唑醇包被抗原的制备包括如下步骤：将50mg卵清蛋白用0.05mol/LPB缓冲液溶解，得到蛋白B液；将9mg戊唑醇半抗原用1mLN,N-二甲基甲酰胺溶解，加入0.3mL乙二胺，冷却到0-5℃，滴加86μL氯甲酸异丁酯，继续反应2h，然后滴加到上述蛋白B液中，反应2h，用0.02mol/LPBS缓冲液透析纯化3天，分装冻存。本专利技术的第五个目的是提供一种戊唑醇抗体，它是由上述戊唑醇免疫抗原经动物免疫得到，其能与戊唑醇发生特异性免疫反应。进一步地，所述戊唑醇抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。本专利技术的第六个目的是提供上述戊唑醇抗体在检测戊唑醇残留中的应用。本专利技术具有如下有益效果：本专利技术提供的戊唑醇半抗原既最大程度保留了戊唑醇的特征结构，使得戊唑醇半抗原的免疫原性明显增强，又具有可以与载体蛋白发生偶联的羧基；用戊唑醇半抗原与载体蛋白偶联后得到的戊唑醇免疫抗原去免疫动物，更有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体，为后续建立戊唑醇的各种免疫分析方法提供基础。本专利技术中采用戊唑醇与丁二酰氯反应制备戊唑醇半抗原，反应步骤简单，所需实验条件温和、易于控制，制备的戊唑醇半抗原的纯度和产率较高。采用本专利技术的戊唑醇免疫抗原得到的戊唑醇抗体的效价、特异性、亲和力都较好，灵敏度可达0.05μg/L，与其他农药的交叉反应率低。附图说明图1是本专利技术戊唑醇半抗原的合成路线具体实施方式第一方面，本专利技术提供一种戊唑醇半抗原，其具有如下结构式：本专利技术提供的戊唑醇半抗原既最大程度保留了戊唑醇的特征结构，使得戊唑醇半抗原的免疫原性明显增强，又具有可以与载体蛋白发生偶联的羧基；用戊唑醇半抗原与载体蛋白偶联后得到的戊唑醇免疫抗原去免疫动物，更有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体。第二方面，本专利技术提供上述戊唑醇半抗原的制备方法，其是由戊唑醇与丁二酰氯反应得到。优选地，戊唑醇半抗原的制备方法为：取戊唑醇加无水二氯甲烷溶解，加三氯化铝，充分搅拌后，加入丁二酰氯，室温搅拌反应12h，反应完毕后，进行分离纯化后得到戊唑醇半抗原；其中，所述戊唑醇、三氯化铝和丁二酰氯的物质的量之比为1:(4-5):(1-2)。本专利技术中采用戊唑醇与丁二酰氯反应制备戊唑醇半抗原，反应步骤简单，所需实验条件温和、易于控制，制备的戊唑醇半抗原的纯度和产率较高。第三方面，本专利技术还提供一种戊唑醇人工抗原，所述戊唑醇人工抗原包括戊唑醇免疫抗原和戊唑醇包被抗原，所述戊唑醇人工抗原是载体蛋白和上述戊唑醇半抗原偶联得到的偶联物。优选地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白。戊唑醇半抗原分子仅具有免疫反应性，而不具有免疫原性。因此，为了赋予戊唑醇半抗原分子以免疫原性，还需要将该戊唑醇半抗原分子与合适的载体蛋白分子偶联、结合在一起，由此产生既具有免疫反应性又具有免疫原性的戊唑醇人工抗原。第四方面，本专利技术还提供上述戊唑醇人工抗原的制备方法，其中所述戊唑醇免疫抗原的制备包括如下步骤：将50mg牛血清白蛋白用0.05mol/LPB缓冲液溶解，得到蛋白A液；将15mg戊唑醇半抗原用1mLN,N-二甲基甲酰胺溶解，加入11mg碳二亚胺、9.7mgN-羟基琥珀酰亚胺，吹打混匀，室温反应2h，然后滴加到上述蛋白A液中，反应2h，用0.02mol/LPBS缓冲液透析纯化3天，分装冻存；所述戊唑醇包被抗原的制备包括如下步骤：将50mg卵清蛋白用0.05mol本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种戊唑醇半抗原，其特征在于，其具有如下结构式：/n

【技术特征摘要】
1.一种戊唑醇半抗原，其特征在于，其具有如下结构式：





2.如权利要求1所述的戊唑醇半抗原的制备方法，其特征在于，其是由戊唑醇与丁二酰氯反应得到。


3.如权利要求2所述的戊唑醇半抗原的制备方法，其特征在于，该制备方法为：取戊唑醇加无水二氯甲烷溶解，加三氯化铝，充分搅拌后，加入丁二酰氯，室温搅拌反应12h，反应完毕后，进行分离纯化后得到戊唑醇半抗原；其中，所述戊唑醇、三氯化铝和丁二酰氯的物质的量之比为1:(4-5):(1-2)。


4.如权利要求2所述的戊唑醇半抗原的制备方法，其特征在于，该制备方法的具体步骤如下：取戊唑醇0.307g加无水二氯甲烷80mL溶解，加三氯化铝0.57g，充分搅拌后，加入丁二酰氯0.16g，室温搅拌反应12h，反应完毕后，加水70mL振荡、静置，去除水相，旋蒸蒸干，上硅胶柱，用体积比为1:1的石油醚-乙酸乙酯洗脱分离，得到戊唑醇半抗原。


5.一种戊唑醇人工抗原，其特征在于，所述戊唑醇人工抗原包括戊唑醇免疫抗原和戊唑醇包被抗原，所述戊唑醇人工抗原是载体蛋白和权利要求1所述的戊唑醇半抗原偶联得到的偶联物。


6.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：万宇平，何方洋，朱亮亮，冯才伟，崔海峰，崔娜，马玉华，王兆芹，曹东山，
申请(专利权)人：北京勤邦生物技术有限公司，北京望尔生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11