一种同时检测血浆中ACC007、拉米夫定和替诺福韦的方法技术

本发明专利技术公开了一种同时测定血浆中ACC007、拉米夫定和替诺福韦的方法，先对血浆样品预处理，再采用高效液相色谱串联质谱进行定量测定，利用内标法定量，同时对血浆中三种药物的浓度进行分析测定。该方法灵敏度高、特异性强、精密度好、准确度高、稳定性好、提取回收率高、无明显基质效应和稀释效应等优点，适用于同时分析血浆中ACC007、拉米夫定和替诺福韦的量。

A method for simultaneous determination of acc007, lamivudine and tenofovir in plasma

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测血浆中ACC007、拉米夫定和替诺福韦的方法
本专利技术属于医药中的药物分析检测技术，特别是涉及一种同时检测血浆中ACC007、拉米夫定和替诺福韦的方法。
技术介绍
拉米夫定和富马酸替诺福韦二吡呋酯均为核苷类逆转录酶抑制剂(Nucleosidereversetranscriptaseinhibitors,NRTIs)，拉米夫定对乙型肝炎病毒(HBV)和人免疫缺陷病毒(HIV)有较强的抑制作用，富马酸替诺福韦二吡呋酯(Tenofovirdsoproxilfumarate)是替诺福韦的前药，口服给药后富马酸替诺福韦二吡呋酯在胃肠道迅速吸收，随后经酯酶水解成单酯中间体和活性成分替诺福韦，从而发挥药理活性。ACC007为非核苷类逆转录酶抑制剂(Non-nucleosidereversetranscriptaseinhibitor，NNRTI)，由江苏艾迪药业股份有限公司开发，具有优良的抗HIV病毒活性和很好的安全性。3种药物的化学结构式如图1所示。ACC007和拉米夫定、富马酸替诺福韦二吡呋酯三个药物联合使用，以“鸡尾酒疗法”用于治疗HIV感染。建立一种在血浆中同时检测ACC007、拉米夫定和替诺福韦的方法，就不必采用针对三种药物的不同检测方法，这样有助于加快检测时间，减少检测溶剂的使用，具有节能环保的效果。
技术实现思路
专利技术目的：针对上述现有技术，本专利技术提供了一种利用高效液相色谱串联质谱技术，能够实现灵敏度高、重复性好、准确度高的同时检测血浆中ACC007、拉米夫定和替诺福韦的方法。技术方案：本专利技术所述的一种同时检测血浆中ACC007、拉米夫定和替诺福韦的方法，其采用高效液相色谱串联质谱技术检测经预处理的血浆样品，利用内标法定量，以ACC007、拉米夫定、替诺福韦标准样品的浓度为X轴，以标准样品与内标的峰面积比值为Y轴，建立标准曲线方程，将ACC007、拉米夫定和替诺福韦与内标峰面积的比值代入标准曲线，计算得到ACC007、拉米夫定和替诺福韦的浓度；具体色谱-质谱条件为：(1)高效液相色谱条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A：10nM醋酸铵含0.1％甲酸；流动相B：甲醇；柱温：40℃；流速：0.4mL/min；采用梯度洗脱方式，梯度见表1：表1流动相梯度表(2)质谱条件：采用电喷雾电离源(ESI)，正离子扫描(高灵敏度模式)方式检测，GAS1：55psi，GAS2：55psi，CurtainGAS：30psi，源温度为450℃，多离子反应检测(MRM)，具体的离子信息见表2：表2质谱监测的参数所述血浆为人或动物的血浆。本专利技术中，以甲苯磺丁脲为内标，所述内标工作溶液为含甲苯磺丁脲的甲醇。所述血浆样品预处理方法如下：取血浆25μL，加入100μL含内标甲苯磺丁脲500nM的甲醇，涡流1min后沉淀蛋白，13000rpm离心10min后，定量吸取20μL上清液加入80μL去离子水，涡流1min即得。本专利技术所述标准曲线的建立方法如下：取空白血浆，配制成相当于ACC007、拉米夫定、替诺福韦血浆浓度为10、20、40、50、80、100、200、400、500、800、1000、2000ng/mL的标准系列样品；按血浆样品预处理方法进行操作，建立ACC007、拉米夫定、替诺福韦的标准曲线，ACC007线性范围为10ng/mL到2000ng/mL，拉米夫定和替诺福韦线性范围为20ng/mL到2000ng/mL，以待分析物浓度为横坐标(X)，待分析物与内标甲苯磺丁脲的峰面积比值为纵坐标(Y)，其中ACC007和替诺福韦用加权(W＝1/X2)最小二乘法进行回归运算，拉米夫定用Power曲线回归，求得直线回归方程即为标准曲线。有益效果：本专利技术建立了一种同时测定血浆中ACC007、拉米夫定和替诺福韦的方法，可以同时满足三种不同药物的检测需求，可减轻检测工作强度，节约时间，降低溶剂的使用，经济环保。经方法学验证，本专利技术方法灵敏度高、特异性强、精密度好、准确度高、稳定性好，能够用于血浆中ACC007、拉米夫定和替诺福韦的含量测定。附图说明图1为3种药物的化学结构式，其中(A)ACC007；(B)拉米夫定；(C)富马酸替诺福韦二吡呋酯；图2为ACC007(A)、拉米夫定(B)、替诺福韦(C)和甲苯磺丁脲(D)的一级全扫描质谱图；图3为ACC007(A)、拉米夫定(B)、替诺福韦(C)和甲苯磺丁脲(D)的[M+H]+产物离子全扫描质谱图；图4为定量下限浓度的ACC007(A)，拉米夫定及替诺福韦(B)犬血浆样品MRM色谱图；图5为比格犬空白血浆样品MRM色谱图。具体实施方式为了更好地说明本专利技术，以便理解本专利技术的技术方案，下面结合具体实施例对本专利技术作进一步详细说明。实施例1：比格犬血浆中ACC007、拉米夫定和替诺福韦的同时测定1、仪器与试剂岛津LC-20AD液相色谱系统(包括DGU-20A3型真空脱气机，SIL-20A自动进样器，LC-20AD型二元输液泵，CTO-20AC型柱温箱)，日本岛津公司；API4000QTrap型三重四极杆串联质谱仪，配备加热电喷雾电离源(ESI源)，美国ABSCIEX公司。ACC007，纯度为98.3％，由江苏艾迪药业有限公司提供；富马酸替诺福韦二吡呋酯，含量98.5％，来自石家庄龙泽制药股份有限公司；拉米夫定，含量99.7％，来自石家庄龙泽制药股份有限公司；甲苯磺丁脲(Tolbutamide)，购自美国Aladdin公司；乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)购自德国Merck公司；甲酸(色谱纯)购自美国Sigma公司；乙酸铵(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司。2、血浆样品采集比格犬采购于北京玛斯生物技术有限公司，实验前一周内未参加过实验，未服用过其他药物，给药前比格犬身体状况正常，实验前比格犬禁食12hr，实验当天早晨空腹给予药物，于给药前及给药后定时采集前肢静脉血1mL至预先用1.5％EDTA抗凝的采血管中，以13000rpm离心10min后转移全部上层血浆，-80℃贮存。3、样品处理方法取犬血浆25μL，加入100μL含内标甲苯磺丁脲500nM的甲醇，涡流1min后沉淀蛋白，13000rpm离心10min后，定量吸取20μL上清液加入80μL去离子水，涡流1min，吸取80μL至进样瓶，10μL进样分析。超出最高检测浓度的样品经犬空白血浆稀释后测定。4、色谱-质谱条件色谱条件：色谱柱：BONNA-AgelaTMVenusilMPC18column(2.1×150mm，5.0μm)，中国博纳艾杰尔科技有限公司；柱温为40℃；流速为0.4mL/min；流动相梯度见表1，表1流动相梯度表保留时间：ACC007tR≈3.90min，拉米夫定tR≈3.22min，替诺福韦tR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时检测血浆中ACC007、拉米夫定和替诺福韦的方法，其特征在于，采用高效液相色谱串联质谱技术检测经预处理的血浆样品，利用内标法定量，以ACC007、拉米夫定、替诺福韦标准样品的浓度为X轴，以标准样品与内标的峰面积比值为Y轴，建立标准曲线方程，将ACC007、拉米夫定和替诺福韦与内标峰面积的比值代入标准曲线，计算得到ACC007、拉米夫定和替诺福韦的浓度；具体色谱-质谱条件为：/n(1)高效液相色谱条件：/n流动相A：10nM醋酸铵含0.1％甲酸；/n流动相B：甲醇；/n柱温：40℃；/n流速：0.4mL/min；/n采用梯度洗脱方式，梯度见表1：/n表1流动相梯度表/n

【技术特征摘要】
1.一种同时检测血浆中ACC007、拉米夫定和替诺福韦的方法，其特征在于，采用高效液相色谱串联质谱技术检测经预处理的血浆样品，利用内标法定量，以ACC007、拉米夫定、替诺福韦标准样品的浓度为X轴，以标准样品与内标的峰面积比值为Y轴，建立标准曲线方程，将ACC007、拉米夫定和替诺福韦与内标峰面积的比值代入标准曲线，计算得到ACC007、拉米夫定和替诺福韦的浓度；具体色谱-质谱条件为：
(1)高效液相色谱条件：
流动相A：10nM醋酸铵含0.1％甲酸；
流动相B：甲醇；
柱温：40℃；
流速：0.4mL/min；
采用梯度洗脱方式，梯度见表1：
表1流动相梯度表



(2)质谱条件：
采用电喷雾电离源(ESI)，正离子扫描(高灵敏度模式)方式检测，GAS1：55psi，GAS2：55psi，CurtainGAS：30psi，源温度为450℃，多离子反应检测(MRM)，具体的离子信息见表2：
表2质谱监测的参数





2.根据权利要求1所述的同时检测血浆中ACC007、拉米夫定和替诺福韦的方法，其特征在于，所述血浆为人或动物的血浆。


3.根据权利要求1所述的同时检测血浆中ACC007、拉米夫定...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡雄林，刘三侠，汪仙美，沈小宁，傅和亮，李文全，
申请(专利权)人：江苏艾迪药业股份有限公司，南京安赛莱医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32