一种吡咯喹啉醌的纯化方法技术

本发明专利技术提供一种吡咯喹啉醌的纯化方法，该方法包括以下步骤：将含有吡咯喹啉醌的发酵液进行预处理得到滤液；将所得滤液通过聚酰胺树脂，然后用酸性水溶液冲洗，漏出液废弃；用酸和盐的混合水溶液进行解吸，收集色谱纯度90％以上的解吸液；调整解吸液的pH，先进行超滤，再进行纳滤浓缩；最后进行结晶、干燥。本发明专利技术采用聚酰胺树脂分离吡咯喹啉醌发酵液，再配合结晶能得到HPLC纯度≥98％，含量≥96％的吡咯喹啉醌晶体，且使用的聚酰胺树脂廉价易得，提纯工艺简单，有效降低成本。此外，本发明专利技术使用过后的聚酰胺树脂用碱液即可完成树脂再生，整个过程中使用的有机溶剂大大减少，则废水COD大幅度减少，同时也降低了厂房设施的防爆要求。

A purification method of pyrroloquinoline quinone

【技术实现步骤摘要】
一种吡咯喹啉醌的纯化方法
本专利技术涉及微生物发酵制药领域，更具体地，涉及一种吡咯喹啉醌的纯化方法。
技术介绍
吡咯喹啉醌(Pyrroloquinolinequinone，PQQ)，化学名称为4，5-二氢-4，5-二氧化-1-氢吡咯(2，3f)醌-2，7，9-三羧酸，别名Methaxatin，是一种新型辅酶。1979年Salisbury等人首次从甲基营养菌中分离，并确定其为在细菌细胞中作为膜结合脱氢酶的氧化还原辅因子，它与呼吸链电子传递，也是一种新的B族维生素。新近一些研究发现PQQ具有异常高的氧化还原循环能力，在抗神经细胞衰老和抗癌等方面有很大应用潜力。同时，2008年，美国食品和药物管理局(FDA)批准了以PQQ为主要成分的促进认知功能食品。因此，PQQ作为药物或功能食品具有很好的应用前景。其结构式如下所示：目前，PQQ的生产方法主要是化学合成法及发酵法，化学合成法步骤多、副产物多且难以去除，在国内安全环保越来越严格的情况下，微生物发酵法生产PQQ具有巨大的成本优势。现阶段重点则为从发酵液中提纯PQQ，已经报道的有，武汉大学的赵永芳等人使用DEAE-葡聚凝胶吸附解吸，得到的洗脱液浓缩得到粗品，粗品结晶，再用SeppakC18柱进行吸附解吸，浓缩解吸液得到纯化品，但是此工艺使用的DEAE-葡聚凝胶和SeppakC18都比较昂贵，大规模生产成本很高。有美国专利使用三菱的HP20树脂取代价格比较昂贵的DEAE-葡聚凝胶对PQQ发酵过滤液进行纯化，但是其只是对这两种填料在PQQ的回收率上进行了对比，并未给出分离后PQQ的纯度，也未提及后续的纯化。还有络合萃取分离纯化法、离子对双水相萃取分离结合阴离子交换树脂吸附纯化法等，但上述方法需要使用大量的正己烷、甲醇或乙醇等有机溶剂，工业化应用成本高且污染环境。中国专利CN107056782A中采用非极性大孔树脂吸附，再使用亲水性的硅胶基质的C18制备填料来分离，虽然分离过程中只使用了缓冲液和水，但是使用过后的树脂上会有明显的死吸附，每次使用完必须用高浓度有机溶剂(例如丙酮，95％以上浓度乙醇等)再生才能保证下次的分离性能。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种吡咯喹啉醌的纯化方法。本专利技术提供的吡咯喹啉醌的纯化方法，包括以下步骤：(1)将含有吡咯喹啉醌的发酵液进行预处理，得到滤液；(2)将步骤(1)所得滤液通过聚酰胺树脂，然后用酸性水溶液冲洗，漏出液废弃；(3)将步骤(2)所得聚酰胺树脂用酸和盐的混合水溶液进行解吸，收集色谱纯度90％以上的解吸液；(4)调整步骤(3)所得解吸液的pH，先进行超滤，再进行纳滤浓缩；(5)将步骤(4)所得浓缩液进行结晶、干燥，即得纯化后的吡咯喹啉醌。本专利技术采用聚酰胺树脂分离吡咯喹啉醌发酵液，再配合结晶能得到HPLC纯度≥98％，含量≥96％的吡咯喹啉醌晶体，且使用的聚酰胺树脂廉价易得，有效降低成本。此外，本专利技术使用过后的聚酰胺树脂用碱液即可完成树脂再生，整个过程中使用的有机溶剂大大减少，则废水COD大幅度减少，同时也降低了厂房设施的防爆要求。进一步地，步骤(1)中，所述预处理具体包括：将所述发酵液进行固液分离，所得滤液用酸调节至pH为2.0～2.5，再加入盐至其浓度以滤液体积计为5～15g/L，最后进行过滤，所得滤液进行步骤(2)的处理。进一步地，在上述预处理过程中，将发酵液进行固液分离得到菌渣和滤液可使用本领域常规过滤方法，优选陶瓷膜过滤法，进一步优选陶瓷膜的孔径为50nm。调节pH所用的酸为盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、醋酸中的一种或多种，也可以为稀释后的上述酸，优选为稀盐酸水溶液。加入的盐为氯化钙、醋酸钙中的一种或多种，优选氯化钙。最后进行过滤时，可采用板框过滤、液体滤芯过滤、陶瓷膜过滤等方式，优选过滤介质为平均孔径为0.2～0.6μm的过滤纸板或过滤膜，平均孔径进一步优选为0.45μm。进一步地，步骤(2)中，所述聚酰胺树脂的粒径为200～500目，优选为300～400目。所述酸性水溶液的pH为2.0～2.5，可以选用盐酸和/或醋酸。进一步地，步骤(3)中，所述混合水溶液的pH为6.5±0.2。所述盐为醋酸铵，加入量为2～3g/L，优选为2.5g/L。进一步地，步骤(4)中，调整解吸液pH为6～7。超滤采用孔径为10000道尔顿的超滤膜。纳滤采用孔径为100～200道尔顿的纳滤膜，浓缩至吡咯喹啉醌的含量为1.0～1.5g/L。进一步地，步骤(5)中，所述结晶具体包括：将所述浓缩液加热至28～30℃，调整溶液pH为7.0，加入NaCl至其浓度为1.2～1.3mol/L，用盐酸调节pH为3.5±0.2，降温至5～10℃，保温搅拌2～3小时，抽滤得潮晶，洗涤。进一步地，本专利技术中使用氢氧化钠溶液对聚酰胺树脂进行再生。优选地，所述氢氧化钠溶液浓度为1～3mol/L，进一步优选为1mol/L。使用上述方法进行树脂再生与使用95％乙醇再生后的树脂效果相当，且实验发现，经过30～40次上柱量后，树脂表面会有部分浅黄色富集，使用40～50％浓度的乙醇水溶液洗涤，即可恢复树脂本色。这为工业上减少有机溶剂用量提供了便利，即使长时间间隔一次使用40～50％浓度的乙醇洗涤树脂，只要简单减压蒸馏即可，不像95％以上乙醇回收必须使用精馏塔。能源、废水COD大幅度减少，同时也降低了厂房设施的防爆要求。进一步地，本专利技术中所述含有吡咯喹啉醌的发酵液为由生丝微菌发酵生产得到的。上述优选条件可进行任意组合，从而得到本专利技术较优的实施例。作为本专利技术一个优选的具体实施方式，所述纯化方法具体包括以下步骤：(1)将含有吡咯喹啉醌的发酵液进行固液分离，所得滤液用酸调节至pH为2.0～2.5，再加入盐至其浓度以滤液体积计为5～15g/L，最后进行过滤，得到滤液；(2)将步骤(1)所得滤液通过粒径为200～500目的聚酰胺树脂，然后用pH为2.0～2.5的酸性水溶液冲洗，漏出液废弃；(3)将步骤(2)所得聚酰胺树脂用酸和醋酸铵的混合水溶液进行解吸，所述混合水溶液的pH为6.5±0.2，醋酸铵加入量为2～3g/L，收集色谱纯度90％以上的解吸液；(4)调整步骤(3)所得解吸液的pH为6～7，先进行超滤，再采用孔径为100～200道尔顿的纳滤膜进行纳滤浓缩，浓缩至吡咯喹啉醌的含量为1.0～1.5g/L；(5)将步骤(4)所得浓缩液加热至28～30℃，调整溶液pH为7.0，加入NaCl至其浓度为1.2～1.3mol/L，用盐酸调节pH为3.5±0.2，降温至5～10℃，保温搅拌2～3小时，抽滤得潮晶，洗涤，干燥。本专利技术采用聚酰胺树脂分离吡咯喹啉醌发酵液，再配合结晶能得到HPLC纯度≥98％，含量≥96％的吡咯喹啉醌晶体，且使用的聚酰胺树脂廉价易得，提纯工艺简单，有效降低成本。此外，本专利技术使用过后的聚酰胺树脂用碱液即可完成树脂再生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种吡咯喹啉醌的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)将含有吡咯喹啉醌的发酵液进行预处理，得到滤液；/n(2)将步骤(1)所得滤液通过聚酰胺树脂，然后用酸性水溶液冲洗，漏出液废弃；/n(3)将步骤(2)所得聚酰胺树脂用酸和盐的混合水溶液进行解吸，收集色谱纯度90％以上的解吸液；/n(4)调整步骤(3)所得解吸液的pH，先进行超滤，再进行纳滤浓缩；/n(5)将步骤(4)所得浓缩液进行结晶、干燥，即得纯化后的吡咯喹啉醌。/n

【技术特征摘要】
1.一种吡咯喹啉醌的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将含有吡咯喹啉醌的发酵液进行预处理，得到滤液；
(2)将步骤(1)所得滤液通过聚酰胺树脂，然后用酸性水溶液冲洗，漏出液废弃；
(3)将步骤(2)所得聚酰胺树脂用酸和盐的混合水溶液进行解吸，收集色谱纯度90％以上的解吸液；
(4)调整步骤(3)所得解吸液的pH，先进行超滤，再进行纳滤浓缩；
(5)将步骤(4)所得浓缩液进行结晶、干燥，即得纯化后的吡咯喹啉醌。


2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述预处理具体包括：
将所述发酵液进行固液分离，所得滤液用酸调节至pH为2.0～2.5，再加入盐至其浓度以滤液体积计为5～15g/L，最后进行过滤，所得滤液进行步骤(2)的处理。


3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，所述固液分离采用陶瓷膜过滤法，优选陶瓷膜的孔径为50nm；
和/或，所述盐为氯化钙、醋酸钙中的一种或多种，优选氯化钙；
和/或，最后进行过滤时，过滤介质为平均孔径为0.2～0.6μm的过滤纸板或过滤膜。


4.根据权利要求1～3任一项所述的纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述聚酰胺树脂的粒径为200～500目，优选为300～400目；
和/或，所述酸性水溶液的pH...

【专利技术属性】
技术研发人员：何勇崴，赵燕，张葵，
申请(专利权)人：北大方正集团有限公司，北大医药重庆大新药业股份有限公司，北大医疗产业集团有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11