一种橡胶草菊糖降解酶基因Tk1-FEH及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种橡胶草菊糖降解酶基因Tk1‑FEH及其应用。所述橡胶草菊糖降解酶基因Tk1‑FEH序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术通过Tk1‑FEH基因过表达进行该基因的功能研究，结果显示转Tk1‑FEH基因橡胶草对干旱胁迫的耐受能力显著得到提高，断水38天后仍能保持较好的生长状态，而且正常生长状态下根部生物量显著增加，干根重量提升170％以上，这表明该基因可用于橡胶草和其他作物的抗旱和提高根部生物量转基因研究中。本发明专利技术的橡胶草菊糖降解酶基因Tk1‑FEH来自橡胶草，不会产生基因漂移，对环境影响较小，为提高橡胶草和其他蒲公英属植物的抗旱性和根部生物量提供新的基因资源。

TK1 FEH gene and its application

【技术实现步骤摘要】
一种橡胶草菊糖降解酶基因Tk1-FEH及其应用
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种橡胶草菊糖降解酶基因Tk1-FEH及其应用。
技术介绍
橡胶草(Taraxacumkok-saghyz)为菊科蒲公英属多年生草本植物，原产于哈萨克斯坦以及中国新疆等地，其根部可合成优质的天然橡胶，且与巴西橡胶树所产天然橡胶的结构和性能相似。而且橡胶草具有适应区域广，生长收获期短，可轮种或间作，适合机械化种植和采收等优点，使其成为极具发展前景的产胶作物。但是目前橡胶草种质基本为野生种质，驯化时间短，存在含胶量和生物量低、抗逆性差等问题，通过橡胶草提取天然橡胶的成本仍很高，因此，创制高含胶量、高生物量以及抗逆性强的新种质对橡胶草产业化有着重要的意义。菊糖是橡胶草根部重要的代谢产物，其专一性地在橡胶草根部积累，含量可达到干根重量的10％-50％。菊糖的代谢主要由3个酶催化完成，菊糖的合成是由蔗糖-1-果糖基转移酶(1-SST,EC2.4.1.99)和果聚糖:果聚糖1-果糖基转移酶(1-FFT,EC2.4.1.100)催化完成；而合成的菊糖又可被果聚糖1-外水解酶(1-FEH,EC3.2.1.80)最终降解成单个的蔗糖。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供一种橡胶草菊糖降解酶基因Tk1-FEH及其应用。第一方面，本专利技术提供一种橡胶草菊糖降解酶基因Tk1-FEH，所述橡胶草菊糖降解酶基因Tk1-FEH的核苷酸序列为：i)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；或ii)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或iii)在严格条件下与SEQIDNO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。本专利技术提供用于扩增出上述核苷酸序列的引物对，序列如下：Tk1-FEH-F1：5′-ATGAGCAAGCCTCTTTCCTCC-3′Tk1-FEH-R1：5′-TTAAACTGTGCTTTTTACAGT-3′。本专利技术进一步提供编码上述橡胶草菊糖降解酶基因Tk1-FEH编码的蛋白，氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术进一步提供含有上述橡胶草菊糖降解酶基因Tk1-FEH的生物材料，可以为表达盒、载体、工程菌或转基因细胞。本专利技术进一步提供上述橡胶草菊糖降解酶基因Tk1-FEH或该基因编码的蛋白或上述生物材料在提高植物抗旱能力中的应用。本专利技术进一步提供上述橡胶草菊糖降解酶基因Tk1-FEH或该基因编码的蛋白或上述生物材料在提高植物根部生物量中的应用。本专利技术进一步提供上述橡胶草菊糖降解酶基因Tk1-FEH或该基因编码的蛋白或上述生物材料在培育耐旱转基因植物中的应用。上述植物可选用橡胶草或蒲公英属植物中的一种或两种，优选为橡胶草。本专利技术进一步提供用于检测上述橡胶草菊糖降解酶基因Tk1-FEH的荧光定量PCR检测引物，引物序列如下：Tk1-FEH-QF2：5′-GCGTTTTTGTACCAGAGTACTGATT-3′Tk1-FEH-QR2：5′-GCTTTCATTACATGTATCACACTGC-3′。本专利技术进一步提供上述橡胶草菊糖降解酶基因Tk1-FEH在制备转基因植物中的应用。第二方面，本专利技术提供一种转基因植株的构建方法，包括以下步骤：以橡胶草的cDNA为模板，权利要求2所述引物对为引物扩增获得菊糖降解酶基因Tk1-FEH的cDNA序列；通过转基因技术构建过表达菊糖降解酶基因Tk1-FEH的转基因植物。具体地，步骤如下：(1)提取橡胶草叶片中的总RNA，反转录得到cDNA第一链；(2)以cDNA第一链为模板，上述Tk1-FEH-F1和Tk1-FEH-R1为引物，通过PCR扩增反应获得菊糖降解酶基因Tk1-FEH的cDNA序列；(3)利用电击法将带有Tk1-FEH基因cDNA序列的质粒转化农杆菌；(4)利用转基因技术将带有转化质粒的农杆菌转化目标植物，获得转基因稳定遗传植株。进一步地，转化方法可参照Zhang等(2015)发表的文章(ZhangYX,IaffaldanoBJ,XieWS,BlakesleeJJ,CornishK.(2015)Rapidandhormone-freeAgrobacteriumrhizogenes-mediatedtransformationinrubberproducingdandelionsTaraxacumkok-saghyzandT.brevicorniculatum.IndustrialCropsandProducts66:110-118)进行。本专利技术提供了一种橡胶草菊糖降解酶基因Tk1-FEH及其应用，本专利技术涉及的橡胶草菊糖降解酶基因Tk1-FEH受干旱诱导后表达水平显著提升，而受到脱落酸(ABA)、PEG6000、乙烯利(ETH)和茉莉酸甲酯(MeJA)的抑制；过表达橡胶草菊糖降解酶基因Tk1-FEH的根部生物量和植株抗旱能力得到较大提升，断水38天后仍有着较好的生长状态，而正常生长状态下干根重提高超过170％。附图说明图1为本专利技术实施例2中利用荧光定量PCR检测橡胶草叶片、花、花梗和根部的Tk1-FEH基因的相对表达量的结果示意图；图2为本专利技术实施例2中利用荧光定量PCR检测橡胶草叶片受干旱处理0、7、15、21、25、27、31天以及复水3天后，Tk1-FEH基因的表达情况示意图；图3为本专利技术实施例2中利用荧光定量PCR检测橡胶草叶片受PEG6000处理0、6、12、24、48和72h后，Tk1-FEH基因的表达情况示意图；图4为本专利技术实施例2中利用荧光定量PCR检测橡胶草叶片受脱落酸(ABA)处理0、6、12、24、48和72h后，Tk1-FEH基因的表达情况示意图；图5为本专利技术实施例2中利用荧光定量PCR检测橡胶草叶片受乙烯利(ETH)处理0、6、12、24、48和72h后，Tk1-FEH基因的表达情况示意图；图6为本专利技术实施例2中利用荧光定量PCR检测橡胶草叶片受茉莉酸甲酯(MeJA)处理0、6、12、24、48和72h后，Tk1-FEH基因的表达情况示意图；图7为本专利技术实施例3中转Tk1-FEH基因橡胶草株系和未转基因的橡胶草植株水培60天的表型比较结果图；图8为本专利技术实施例3中转Tk1-FEH基因橡胶草株系和未转基因的橡胶草植株断水处理38天的表型比较结果图。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种橡胶草菊糖降解酶基因Tk1-FEH，其特征在于，所述橡胶草菊糖降解酶基因Tk1-FEH的核苷酸序列为：/ni)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或/nii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或/niii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种橡胶草菊糖降解酶基因Tk1-FEH，其特征在于，所述橡胶草菊糖降解酶基因Tk1-FEH的核苷酸序列为：
i)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；或
ii)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或
iii)在严格条件下与SEQIDNO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。


2.一种用于扩增出权利要求1所述橡胶草菊糖降解酶基因Tk1-FEH的引物对，其特征在于，序列如下：
Tk1-FEH-F1：5′-ATGAGCAAGCCTCTTTCCTCC-3′
Tk1-FEH-R1：5′-TTAAACTGTGCTTTTTACAGT-3′。


3.权利要求1所述橡胶草菊糖降解酶基因Tk1-FEH编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。


4.含有权...

【专利技术属性】
技术研发人员：覃碧，王锋，张立群，刘实忠，聂秋海，张继川，王肖肖，杨玉双，甘霖，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院橡胶研究所，北京玲珑蒲公英科技发展有限公司，北京化工大学，
类型：发明
国别省市：海南;46