一种病毒灭活试验中残留消毒剂的去除方法技术

本发明专利技术属于消毒学技术领域，涉及一种病毒灭活试验，尤指一种病毒灭活试验中残留消毒剂的去除方法，包括步骤：1)准备步骤：制备病毒悬液；2)去除步骤：首先吸取消毒剂于试管内，水浴作用后进行除药处理，其次进行30‑50倍稀释后超速离心，再其次弃上清液，最后加入细胞维持液再次稀释混匀，去除残留消毒剂；3)检测步骤：吸加病毒悬液并混匀，吸取最终样本进行病毒滴度测定；本发明专利技术采用的残留消毒剂去除方法，可减少整过程中的消毒剂去除的试验时间，并且可以大程度提高病毒灭活试验的试验效率，避免化学中和方式中消毒剂、中和剂对细胞和病毒的影响。

A method of removing residual disinfectant in virus inactivation test

【技术实现步骤摘要】
一种病毒灭活试验中残留消毒剂的去除方法
本专利技术属于消毒学
，涉及一种病毒灭活试验，尤指一种病毒灭活试验中残留消毒剂的去除方法。
技术介绍
随着社会经济的发展、环境的变迁、人们生活方式的改变等，一些新发和不明原因传染病(艾滋病、SARS、禽流感、寨卡、手足口、埃博拉、埃可病毒等)，医院感染暴发和突发公共卫生事件频发，严重影响人们的健康及社会稳定。病毒引起的传染性疾病由于其爆发快，传染性强，极易造成严重后果，一旦发生后其传播途径与感染机制在短时间内是很难明确的，针对性预防和控制措施较难及时开展，而治疗病毒性传染病的特效药物与疫苗的研究生产需要进行大量的前期研究，一系列的原因导致在突发公共卫生事件和医院感染事件中，人类的措施存在相当大的滞后性；因此，为解决上述问题，普遍认为消毒是切断病毒的传播途径、预防和控制病毒传播的最简单、最有效的手段。消毒工作是依靠消毒产品来实现的，《中华人民共和国传染病防治法》第29条，明确了消毒产品用于传染病防治的属性，因而消毒产品对病毒的灭活效果直接关系到人们的健康及社会稳定，我国对消毒产品病毒灭活效果的评价方法主要参照《消毒技术规范(2002版)》等法律法规及相关标准，一般选用脊髓灰质炎病毒-I型疫苗株(PV-I)作为指标病毒，该评价方法中的残留消毒剂的去除是关键，若残留消毒剂去除不彻底，则无法得到最准确、客观的病毒灭活效果的结果，导致评价结果失真。为了准确检测、鉴定和评价消毒剂病毒灭活性能，经过一定的灭活时间后，需要去除残留消毒剂。目前残留消毒剂的去除方法主要包括化学中和法与物理法，化学中和法利用化学物质之间的拮抗作用消除残留消毒剂，但是该方法中不同的化学中和剂以及中和后的产物都可能会对细胞产生影响。每次检测时需要去除残留消毒剂方法需鉴定合格后方可应用，但是中和剂法存在相当的不足：1、复方型消毒剂中和剂成分筛选十分繁琐且成功率十分低；2、不同的消毒剂有效物浓度不一致，常用中和剂成分的浓度不一定合理；3、中和剂成分本身不能对微生物或细胞有害。因此化学中和法需要进行足量的预备试验，耗费大量的时间和人力，而且随着消毒剂成分越来越复杂，合适的化学中和剂越来越难以寻找，已成为病毒灭活试验中难点；物理法包括稀释法，吸附柱法，分子筛柱法以及载体冲洗法，这些方法对消毒剂或者病毒有特殊要求，不能普遍性的推广。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术属于消毒学
，旨在公开一种病毒灭活试验，尤指一种病毒灭活试验中残留消毒剂的去除方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种病毒灭活试验中残留消毒剂的去除方法，其特征在于，所述的去除方法包括以下步骤：1)准备步骤：制备病毒悬液；2)去除步骤：首先吸取消毒剂于试管内，水浴后进行除药处理，其次进行30～50倍稀释后超速离心，再其次弃上清液，最后加入细胞维持液进行稀释混匀，去除残留消毒剂；3)检测步骤：吸加病毒悬液并混匀，进行病毒滴度测定。优选地，所述步骤2)的水浴温度为20℃±1℃，时间为5min，离心条件为：转速为10000rpm～25000rpm，离心时间为1h～2.5h，温度为4℃。优选地，所述步骤2)的加入细胞维持液进行稀释混匀后的体积为1mL～2mL。优选地，所述步骤3)的检测步骤采用终点稀释法或噬斑法计算病毒感染滴度，以进行病毒滴度的测定。优选地，所述步骤1)的制备病毒悬液包括以下步骤：(1)取冻存的宿主细胞，在37℃温水中迅速融化，用毛细吸管移植于细胞维持液的细胞管内，吹吸4～7次，使细胞与细胞维持液混匀后高速离心，去上清液；然后加入细胞维持液，吹吸数次使混匀，再次离心后，转种于加有完全培养基的培养瓶中；(2)取低温冻存的病毒毒种，37℃水浴融化，采用细胞维持液作10倍稀释，接种于步骤(1)的培养瓶中；然后置于37℃温箱中，以后续收获病毒；(3)将含有病毒与宿主细胞的培养液，在冰浴条件下，采用超声波法或者反复冻融法破碎宿主细胞，释放病毒；然后，离心并去除沉淀，取上清液，即病毒液；按每管1.0mL分装于体积为1.5mL的无菌离心管中，于-80℃冷冻保存；(4)采用1支病毒液按病毒滴度测定法，测定病毒滴度；(5)使用时，病毒液与有机干扰物1:1混合制成病毒悬液。优选地，所述步骤(1)的离心条件为转速3000rpm，时间3min；步骤(3)的离心条件为转速6000rpm，时间15min。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术采用的残留消毒剂去除方法，可减少整过程中的消毒剂去除的试验时间，从传统的21～30天的工作时间缩减为4～7天，并且可以大程度提高病毒灭活试验的检测效率，由于现有的化学中和法应用时产生副作用影响，而本专利技术减少对化学剂的应用，可克服化学剂存在的影响，因此避免采用化学中和的方式可完全消除中和剂对病毒和细胞的不良影响；同时可适用于各类消毒剂和病毒，应用范围广。本专利技术可适用于消毒剂检测或消毒效果评价监测，是一种活的病毒及其细胞感染的检测技术，可用于评价各种用途的消毒因子对测试病毒的杀灭效果。具体实施方式下面详细说明本专利技术的具体实施方式：一种病毒灭活试验中残留消毒剂的去除方法，其特征在于，所述的去除方法包括以下步骤：1)准备步骤：制备病毒悬液；将待测消毒剂用灭菌硬水稀释至使用浓度的1.25倍；2)去除步骤：首先吸取消毒剂于试管内，水浴后进行除药处理，其次进行30～50倍稀释后超速离心，再其次弃上清液，最后加入细胞维持液进行稀释混匀，去除残留消毒剂；本实施例中，加入细胞维持液并稀释混匀后体积为1mL～2mL，病毒悬液与消毒剂的容积比为1:4，病毒悬液为0.2mL～0.4mL；其中水浴温度为20℃±1℃，时间为5min，离心条件为：转速10000rpm～25000rpm，离心时间1h～2.5h，温度4℃；3)检测步骤：吸加病毒悬液并混匀，吸取最终样本进行病毒滴度测定；检测步骤采用终点稀释法或噬斑法计算病毒感染滴度，以进行病毒滴度的测定；所述步骤1)的制备病毒悬液还包括以下步骤：(1)取冻存的宿主细胞，从液氮中取出，在37℃温水中迅速融化，用毛细吸管移植于细胞维持液的细胞管内，吹吸4～7次，使细胞与细胞维持液混匀后高速离心，去上清液；然后加入细胞维持液，吹吸数次使混匀，再次离心后，转种于加有10mL完全培养基的培养瓶中，逐日观察细胞生长情况，在细胞长满单层时，用于消毒检测；离心条件为转速3000rpm，时间3min；(2)取低温冻存的病毒毒种，37℃水浴融化，采用细胞维持液作10倍稀释，接种于步骤(1)的培养瓶中，如步骤(1)长满单层细胞的培养瓶；然后置于37℃温箱中，使细胞吸附、生长，逐日观察病变，待3/4细胞出现病变时，收获病毒；(3)将含有病毒与宿主细胞的培养液，在冰浴条件下，采用超声波或反复冻融破碎宿主细胞，释放病毒；然后，离心并去除沉淀，沉淀主要为细胞碎片，取上清液，即病毒液；按每管1.0mL分装于体积为1.5mL的无菌离心管中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种病毒灭活试验中残留消毒剂的去除方法，其特征在于，所述的去除方法包括以下步骤：/n1)准备步骤：制备病毒悬液；/n2)去除步骤：首先吸取消毒剂于试管内，水浴后进行除药处理，其次进行30～50倍稀释后超速离心，再其次弃上清液，最后加入细胞维持液进行稀释混匀，去除残留消毒剂；/n3)检测步骤：吸加病毒悬液并混匀，进行病毒滴度测定。/n

【技术特征摘要】
1.一种病毒灭活试验中残留消毒剂的去除方法，其特征在于，所述的去除方法包括以下步骤：
1)准备步骤：制备病毒悬液；
2)去除步骤：首先吸取消毒剂于试管内，水浴后进行除药处理，其次进行30～50倍稀释后超速离心，再其次弃上清液，最后加入细胞维持液进行稀释混匀，去除残留消毒剂；
3)检测步骤：吸加病毒悬液并混匀，进行病毒滴度测定。


2.根据权利要求1所述的一种病毒灭活试验中残留消毒剂的去除方法，其特征在于，所述步骤2)的水浴温度为20℃±1℃，时间为5min，离心条件为：转速为10000rpm～25000rpm，离心时间为1h～2.5h，温度为4℃。


3.根据权利要求1所述的一种病毒灭活试验中残留消毒剂的去除方法，其特征在于，所述步骤2)的加入细胞维持液进行稀释混匀后的体积为1mL～2mL。


4.根据权利要求1所述的一种病毒灭活试验中残留消毒剂的去除方法，其特征在于，所述步骤3)的检测步骤采用终点稀释法或噬斑法计算病毒感染滴度，以进行病毒滴度的测定。


5.根据权利要求1所述的一种病毒灭活试验中残留...

【专利技术属性】
技术研发人员：张磊，钟昱文，纪洵敏，彭拓华，张贤昌，张吉凯，郑小凌，
申请(专利权)人：广东省生物制品与药物研究所，广东省疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：广东;44