ASFV株和CD2v基因缺失株鉴别的双重荧光PCR引物及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及ASFV株和CD2v基因缺失株鉴别的双重荧光PCR引物及试剂盒，属于生物技术领域，所述的引物序列如SEQ ID NO.1‑6所示。本发明专利技术还公开了包括所述引物的试剂盒：所述试剂盒由以下成分组成：荧光PCR反应液，包含所述引物的混合液，阳性对照和阴性对照；本发明专利技术的6条引物均置于一个管中，混在一起后使用，相互之间不干扰，不会影响后续的PCR扩增和荧光信号值的采集，且能够将非洲猪瘟野毒株和缺失毒株鉴别开。

Double fluorescent PCR primers and kits for the identification of ASFV strain and cd2v gene deficient strain

【技术实现步骤摘要】
ASFV株和CD2v基因缺失株鉴别的双重荧光PCR引物及试剂盒
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的鉴别检测试剂盒。
技术介绍
非洲猪瘟病毒(AfricanSwineFeverVirus，ASFV)是非洲猪瘟病毒科的唯一成员，其基因组为单股DNA病毒，大小为150-190kb，至少可以编码150多种蛋白质。ASFV可以感染各阶段的家猪和野猪，死亡率高达100％。ASFV可以通过直接接触和间接接触传播，污染了ASFV的猪肉、腌制的火腿、泔水、饲料、运输工具、人员等均都可以成为传染源。自1921年首次发现非洲猪瘟疫情以来，非洲猪瘟病毒通过飞机、轮船等多种途径，已经从非洲扩散到欧洲、亚洲等地。我国2018年也暴发了非洲猪瘟疫情，并由此造成了难以计数的经济损失。我国生猪养殖数量占全球养猪总量的一半以上，“猪粮安天下”，生猪的养殖和供给关系人们的生活，也是国家密切关注的热点。如何防治好非洲猪瘟成为动物疫病防控的首要任务。根据疫病的防控规律和经验，急性传染病最有效、最经济的措施是进行基因缺失免疫，然后建立相应的鉴别检测方法进行免疫效果评价，但直到目前为止，非洲猪瘟还没有研制成功有效的疫苗。目前对非洲猪瘟最有效的防控措施主要是检测、扑杀、清除、消毒和常规的生物安全防控等，其中，非洲猪瘟病毒检测是防控非洲猪瘟的关键。目前最常用和最有效的检测方法是针对p72基因等建立的荧光PCR检测方法，可以在1-2小时内检出猪血液、组织样品、环境样品、饲料等中是否含有非洲猪瘟病毒，为采取后续防控措施提供技术支持。在不断提升检测技术的同时，我国科学家也在加紧非洲猪瘟疫苗的研发工作，并取得了令人振奋的进展。根据国外学者O’Donnell等发现ASFV缺失MGF360和505基因会使ASFV毒力变弱的现象，我国学者步志高等(专利CN110093324A)利用基因工程技术，获得了CD2V与MGF360-505R联合缺失的非洲猪瘟病毒双基因缺失株。将该双基因缺失株人工接种猪后，该缺失株的毒力明显减弱，不但不能引起猪发病和死亡，而且对我国非洲猪瘟病毒流行强毒的攻击可产生100％的免疫保护，因此有可能成为我国防控非洲猪瘟的疫苗。该基因缺失株制成的疫苗如果能够上市，将会产生巨大的经济效益。但与此同时，该基因缺失株也存在与野毒株难以鉴别的问题。除了致病性不同以外，该基因缺失株的其他特性与野毒株非常类似，同样可以在猪体内生长和增殖一段时间，同样利用现有的荧光PCR方法无法鉴别。因此，迫切需要解决非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失毒株有效鉴别的问题，以便针对性地采取相应的生物防控措施。
技术实现思路
本专利技术根据非洲猪瘟野毒株和缺失毒株无法鉴别的问题，研发了可以鉴别非洲猪瘟野毒株和非洲猪瘟病毒基因缺失株的鉴别方法，并在此基础上优化条件和试剂进一步研制成功了检测试剂盒。本专利技术是通过如下技术方案来实现的：一组ASFV株和基因缺失株鉴别的双重荧光PCR检测引物，所述的引物序列如下：SEQIDNO.1：5’-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-3’；SEQIDNO.2：5’-HEX-CACCACTTCCATACATGAACCATCTCCCA-BHQ1-3’；SEQIDNO.3：5’-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-3’；SEQIDNO.4：5’-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-3’；SEQIDNO.5：5’-GAAGAAGAACAATGTCAGCATGAT-3’；SEQIDNO.6：5’-AACGACTGTAAGGCTTAGGAAGTAATG-3’；其中，SEQIDNO.1的5’端和3’端分别用FAM和MGB标记，与SEQIDNO.3和SEQIDNO.4组成检测p72基因的一套引物；SEQIDNO.2的5’端和3’端分别用HEX和BHQ1标记，与SEQIDNO.5和SEQIDNO.6组成检测CD2v基因的一套引物。进一步，SEQIDNO.1～6引物的工作浓度均为0.4μm。本专利技术还提供一种包括上述引物组的试剂盒：所述试剂盒由以下成分组成：荧光PCR反应液，包含上述引物的混合液，阳性对照和阴性对照；所述的荧光PCR反应液由PremixExTaqTM酶和2×荧光PCR反应缓冲液混合而成，其中酶混合液中添加有TliRNaseH；所述引物混合液中引物SEQIDNO.1～6的浓度均为1.3mM。所述的阳性对照由含有p72基因和CD2v基因的阳性对照pASFV-PC-p72和pASFV-PC-CD2v的菌液混合而成，用引物SEQIDNO.1～6检测后，Ct值均为24；所述的阴性对照为不添加阳性对照菌液的TE缓冲液，用特异性检测p72基因和CD2v的荧光探针和引物检测后，未出现Ct值和特异性扩增。本专利技术采用基因工程手段，利用中国流行的非洲猪瘟野毒株含有CV2v基因而基因缺失病毒株不含有CD2v基因、同时两种病毒都含有p72基因这一背景的前提下，分别针对这2个基因设计和标记2个不同的探针，一个探针位于p72基因，用FAM标记，只要该探针能够扩增出特异性产物，则说明该病毒含有p72基因，表明该病毒为含有p72基因的非洲猪瘟病毒；另一个探针位于CV2v基因，用HEX标记，只要该探针能够扩增出特异性产物，则说明该病毒含有CD2v基因，表明该病毒为含有CD2v的非洲猪瘟野毒株，扩增不出则表示该非洲猪瘟病毒为非洲猪瘟病毒基因缺失株。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术与现有技术相比的有益效果：本专利技术2套针对非洲猪瘟病毒CD2v和p72基因的荧光探针引物和对应的特异性引物，这6条引物均置于一个管中，混在一起后使用，相互之间不干扰，不会影响后续的PCR扩增和荧光信号值的采集。这套引物能够将非洲猪瘟野毒株和缺失毒株鉴别开。具体实施方式下面通过具体实施方式对本专利技术作进一步的说明，以更好地理解本专利技术，但其内容不构成对本专利技术的限制。实施例11.非洲猪瘟病毒p72基因和CD2v基因的特异性引物和探针的设计和合成根据GenBank上公布的非洲猪瘟病毒全基因组序列(MK333180)，用PrimerPrimer5.0软件设计分别可以检测p72基因和CD2v基因的特异性引物和探针，序列如下：SEQIDNO.1：5’-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-3’；SEQIDNO.2：5’-HEX-CACCACTTCCATACATGAACCATCTCCCA-BHQ1-3’；SEQIDNO.3：5’-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-3’；SEQIDNO.4：5’-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-3’；SEQIDNO.5：5’-GAAGAAGAACAATGTCAGCATGAT-3’；SEQIDNO.6：5’-AACGACTGTAAGGCTTAGGAAGTAATG-3’；其中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组ASFV株和基因缺失株鉴别的双重荧光PCR检测引物，其特征在于所述的引物序列如下：/nSEQ ID NO.1：5’-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-3’；/nSEQ ID NO.2：/n5’-HEX-CACCACTTCCATACATGAACCATCTCCCA-BHQ1-3’；/nSEQ ID NO.3：5’-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-3’；/nSEQ ID NO.4：5’-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-3’；/nSEQ ID NO.5：5’-GAAGAAGAACAATGTCAGCATGAT-3’；/nSEQ ID NO.6：5’-AACGACTGTAAGGCTTAGGAAGTAATG-3’；/n其中，SEQ ID NO.1的5’端和3’端分别用FAM和MGB标记，与SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4组成检测p72基因的一套引物；/nSEQ ID NO.2的5’端和3’端分别用HEX和BHQ1标记，与SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成检测CD2v基因的一套引物。/n

【技术特征摘要】
1.一组ASFV株和基因缺失株鉴别的双重荧光PCR检测引物，其特征在于所述的引物序列如下：
SEQIDNO.1：5’-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-3’；
SEQIDNO.2：
5’-HEX-CACCACTTCCATACATGAACCATCTCCCA-BHQ1-3’；
SEQIDNO.3：5’-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-3’；
SEQIDNO.4：5’-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-3’；
SEQIDNO.5：5’-GAAGAAGAACAATGTCAGCATGAT-3’；
SEQIDNO.6：5’-AACGACTGTAAGGCTTAGGAAGTAATG-3’；
其中，SEQIDNO.1的5’端和3’端分别用FAM和MGB标记，与SEQIDNO.3和SEQIDNO.4组成检测p72基因的一套引物；
SEQIDNO.2的5’端和3’端分别用HEX和BHQ1标记，与SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：张志，李翠翠，孙静，张善鹏，宫枫举，官丽娟，孙学强，
申请(专利权)人：青岛立见诊断技术发展中心，
类型：发明
国别省市：山东;37