本发明专利技术公开了一种用于中华绒螯蟹白斑综合征病毒PCR检测的引物对及试剂盒。本发明专利技术提供了一种用于中华绒螯蟹白斑综合征病毒PCR检测的引物对，本发明专利技术的引物对根据如SEQ ID NO.3所示的中华绒螯蟹白斑综合征病毒特异性序列进行设计，实现了中华绒螯蟹白斑病毒的PCR检测。本发明专利技术实现了中华绒螯蟹白斑病毒的快速检测，从模板DNA制备、PCR反应、阳性对照体系均有预混液，实现了检测操作过程的标准化、简单化，且可大大减少了操作过程中所引起的污染，减少人为操作所引起的误差。本发明专利技术可广泛应于养殖生产中中华绒螯蟹白斑病毒的检测和评估其在养殖生产中的潜在危害。与宏基因组、宏转录组批量检测相比，本发明专利技术的技术方案具有速度快、费用低、针对性强，应用性好。
Primer pair and kit for PCR detection of Eriocheir sinensis white spot syndrome virus
【技术实现步骤摘要】
用于中华绒螯蟹白斑综合征病毒PCR检测的引物对及试剂盒
本专利技术涉及一种用于中华绒螯蟹白斑综合征病毒PCR检测的引物对及试剂盒，属于生物检测
技术介绍
对虾白斑综合症病毒(Whitespotsyndromevirus,WSSV)在分类上属线形病毒科(Nimaviridae)、白斑病毒属(Whispovirus)，是一种大型的杆状双链DNA病毒，具有双层囊膜，不能形成包涵体。囊膜大小为210-420nm×70-167nm，病毒核衣壳大小为180-420nm×54-85nm。WSSV是一种复制迅速和极其致命的对虾病原体，它于1992首次在中国台湾被发现，然后传播到日本和几乎所有亚洲国家。目前在全球范围内WSSV是危害对虾养殖业最严重的病原。WSSV除了能感染大多数对虾品种之外，还能感染其它非对虾种类，如端足类、介形类、蟹类、龙虾类、桡足类、水蝇类等甲壳纲动物，迄今为止，已报道有90种以上的节肢动物是WSSV的宿主或携带者。其外，也发现蠕虫、轮虫也是WSSV的携带者或中间宿主。已有一些报道指出海鸟也是WSSV传播的潜在来源。蟹是一种广泛养殖的水产品种，已在蓝蟹(Callinectessapidus)、中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)、淡水蟹(Paratelphusahydrodomus、P.pulvinata)、印度海蟹(Indianmarinecrabs)、远海梭子蟹(Portunuspelagicus)，mudcrab巨缘青蟹(Scyllaserrata)等38种蟹中通过PCR检测到WSSV。中华绒螯蟹是我国养殖量最大的蟹种，2015年有学者首次报道池塘养殖的中华绒螯蟹感染WSSV，造成很高的死亡率。WSSV有多种分离株，其毒力有所差异。肌肉注射WSSV-TW型和WSSV-CN-Pc克氏原螯虾(Procambarusclarkii)均在第6天出现100％的死亡；但罗氏沼虾在肌肉注射WSSV-TW后未出现死亡，但在注射WSSV-CN-Pc后的第9天死亡率达100％。经口注射WSSV-CN-Pc和WSSV-TW的克氏原螯虾均在第16天出现100％的死亡；罗氏沼虾经口注射WSSV-CN-Pc后的第19天死亡率为100％，但注射WSSV-TW的实验组并未出现死亡。说明不同的WSSV分离株的毒力不同，同一个分离株对不同宿主的毒力也不同。WSSV是白斑病毒属(Whispovirus)的一个种，WSSV可以感染中华绒螯蟹，但中华绒螯蟹是否存在自己的白斑病毒目前还无明确的报道。通过组织病理学观察和电子显微镜观察，可以判断宿主是否感染白斑病毒，但在分类上难以判断是哪一种病毒。分子生物学的方法为白斑病毒的种类鉴定和检测提供了强有力的手段。利用一对WSSV特异性引物，结合一条特异性探针，用荧光PCR技术对WSSVDNA进行体外扩增检测，用于对可疑感染者的病原学诊断。现有的文献中提供了多种WSSV的检测方法，但是现有的这些检测均只涉及到对虾WSSV，并没有涉及到感染中华绒螯蟹的白斑病毒属的其它成员。有关中华绒螯蟹病毒性疾病的研究非常有限，养殖生产上经常发生一些不明病因或病原的疾病，例近年来常发的中华绒螯蟹肝胰腺坏死征。因此，分离鉴定、检测中华绒螯蟹组织中的相关病毒，掌握其宿主域及危害，对中华绒螯蟹的疾病防治有重要意义，对防止或限制其传播有重要帮助，也能够帮助评价其对野生群体的潜在危害。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供一种检测、鉴定中华绒螯蟹白斑病毒方法。本专利技术的第一个目的是提供一种用于中华绒螯蟹白斑综合征病毒PCR检测的引物对，所述引物对根据中华绒螯蟹白斑综合征病毒特异性序列进行设计。进一步地，所述的中华绒螯蟹白斑综合征病毒特异性序列的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。进一步地，所述的中华绒螯蟹白斑综合征病毒保守区域的核苷酸序列还包括保持SEQIDNO.3所示的序列的5’端21个碱基、3’端21个碱基不变，序列中有5-7个碱基随机错配得到的序列。进一步地，所述的引物对包括：正向引物(SEQIDNO.1)：5’-CCTACACAGTCCGTCGTGAAG-3’；反向引物(SEQIDNO.2)：5’-CGTTCCGTTGACCATAGGGAG-3’。进一步地，所述的引物对还包括在上述引物对3’端碱基不变，序列中1-3个碱基错配得到的引物对。本专利技术的第二个目的是提供一种试剂盒，所述的试剂盒包含所述的用于中华绒螯蟹白斑综合征病毒PCR检测的引物对。进一步地，所述的试剂盒还包含冻干DNA提取试剂、冻干PCR检测试剂和对照质粒。进一步地，所述的DNA提取试剂为1000mmolTris-HCl、250mmolEDTA、5000mmolNaCl、10％SDS、10％NP40和10000μg/ml蛋白酶K。进一步地，所述的PCR检测试剂为10×PCR缓冲液、4dNTPsMix、250pmol/L引物对、25mMMgCl2、5U/μLTaqDNA聚合酶。进一步地，所述的对照质粒含有如SEQIDNO.3所示的中华绒螯蟹白斑综合征病毒特异性序列。本专利技术的第三个目的是提供所述的试剂盒检测中华绒螯蟹白斑综合征的方法，包括如下步骤：(1)在组织总DNA提取管中，加0.5-1mL双蒸水溶解，制备组织总DNA提取液，尔后与0.1g待检组织混合，55度保温0.5-1小时，沸水浴加热5分钟，离心10分钟，取上清作为DNA模板；(2)在待检样品PCR管中，加24μL双蒸水，溶解后加1μLDNA模板；(3)在阳性对照PCR管中，加25μL双蒸水溶解；(4)将步聚2、3的PCR管进行PCR扩增，扩增条件为：93-95度预变性3分钟后，按94度变性30秒、50-60度退火30秒、72度延伸15-25秒，共扩增25-35个循环，最后72度延伸10分钟；(5)PCR反应结束后，取8-10μL反应产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离，尔后在紫外观察仪下观察，如果待检样品和阳性对照均可观察到0.25kb的特异性条带，则可判别为待检样品中含有中华绒螯蟹白斑病毒，如果待检样品中没有观察到0.25kb的特异性条带，而阳性对照中可观察到0.25kb的特异性条带，则可判别为待检样品中无中华绒螯蟹白斑病毒。本专利技术的有益效果是：(1)目前还没有任何有关中华绒螯蟹白斑病毒的报道，更没有该病毒检测方法的报道，因此现有组织病理学观察、电子显微镜检测不能正确判断组织样品中是否含有中华绒螯蟹白斑病毒；现有的对虾WSSV的检测方案也不适合用于区分中华绒螯蟹白斑病毒。本专利技术实现了中华绒螯蟹白斑病毒的PCR检测。(2)本专利技术实现了中华绒螯蟹白斑病毒的快速检测，从模板DNA制备、PCR反应、阳性对照体系均有预混液，实现了检测操作过程的标准化、简单化，且可大大减少了操作过程中所引起的污染，减少人为操作所引起的误差。由于PCR技术已非常普及，因此在一般的生物学实验室均可实现，本专利技术可广泛应于养殖生产中中华绒螯蟹白斑病毒的检本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于中华绒螯蟹白斑综合征病毒PCR检测的引物对，其特征在于，所述引物对根据中华绒螯蟹白斑综合征病毒特异性序列进行设计。/n
【技术特征摘要】
1.一种用于中华绒螯蟹白斑综合征病毒PCR检测的引物对，其特征在于，所述引物对根据中华绒螯蟹白斑综合征病毒特异性序列进行设计。
2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述的中华绒螯蟹白斑综合征病毒特异性序列的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。
3.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于，所述的中华绒螯蟹白斑综合征病毒保守区域的核苷酸序列还包括保持SEQIDNO.3所示的序列的5’端21个碱基、3’端21个碱基不变，序列中有5-7个碱基随机错配得到的序列。
4.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述的引物对包括：
正向引物(SEQIDNO.1)：5’-CCTACACAGTCCGTCGTGAAG-3’；
反向引物(SEQIDNO.2)：5’-CGTTCCGTTGACCATAGGGAG-3’。
5.根据权利要求4所述的引物对，其特征在于，所述的引物对还包括在上述引物对3’端碱基不变，序列中1-3个碱基错配得到的引物对。
6.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含权利要求1-5任一项所述的用于中华绒螯蟹白斑综合征病毒PCR检测的引物对。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包含DNA提取试剂、PCR检测试剂和对照质粒。
8.根...
【专利技术属性】
技术研发人员：贡成良，冯永杰，顾玉超，李鳗芸，谢美萍，周阳，鲍胜华，薛仁宇，曹广力，胡小龙，朱敏，张星，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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