帕利亚姆血清群病毒的实时荧光定量RT-PCR检测引物、探针及检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及帕利亚姆血清群病毒的实时荧光定量RT‑PCR检测引物、探针及检测试剂盒，属于动物病毒分子生物检测技术领域。该试剂盒包括上游引物、下游引物、与引物配合使用的探针、阴性对照模板、阳性对照模板、标准品模板和PCR扩增试剂。采用试剂盒进行检测，反应速度快，整个扩增过程不到1个小时；且只需要提取病毒RNA，无需进行反转录，操作步骤少且简便，能够有效地避免RNA降解和污染；同时，在qRT‑PCR扩增完成后，无需琼脂糖凝胶电泳即可直接判断待检样品是否有PALV RNA的存在；并且配合利用标准品模板建立的标准曲线能够对临床样本内PALV RNA进行定量检测，大大提高工作效率，降低了检测成本。

Real time fluorescent quantitative RT-PCR detection primer, probe and detection kit of paryam serogroup virus

【技术实现步骤摘要】
帕利亚姆血清群病毒的实时荧光定量RT-PCR检测引物、探针及检测试剂盒
本专利技术属于动物病毒分子生物学检测
，具体涉及应用TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术对中国流行的帕利亚姆血清群病毒进行快速检测的扩增引物、TaqMan探针及组装的检测试剂盒。
技术介绍
帕利亚姆血清群病毒(Palyamserogroupvirus,PALV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)成员，广泛流行于北纬49°至南纬35°之间的热带以及亚热带地区。PALV主要通过雌性吸血昆虫库蠓(Culicoides)对动物的吸血性叮咬传播，感染牛羊等反刍动物，导致妊娠动物的生产异常，主要表现为流产、早产、死产或产无脑畸形胎。1985年至1986年，帕利亚姆病毒疫情在曾在日本爆发，其临床症状为新生牛先天性异常，并伴有水脑畸形和小脑发育不良综合征，给畜牧业生产带来了巨大的经济损失。PALV基因组由10个双链RNA节段(Seg1～Seg10)构成，共编码7个结构蛋白(VP1～VP7)和4个非结构蛋白(NS1～NS3和NS3A)。PALV具有双层衣壳结构，外层衣壳由Seg-2和Seg-6编码的VP2和VP5构成，主要参与介导宿主细胞表面吸附以及细胞膜通透等生物学过程。Seg-2和Seg-5都具有高度的遗传变异性，其中，由Seg-2编码的VP2是诱导被感染动物产生中和抗体的主要抗原，对PALV血清型具有决定性作用。而Seg-3和Seg-7编码的VP3和VP7则构成内层衣壳，VP3组成内层衣壳的骨架，VP7除了参与内层衣壳的构成外，还可能介导病毒粒子对昆虫宿主细胞的感染。Seg-3和Seg-7序列保守程度较高，其中VP7是PALV血清群特异性抗原。PALV具有多种不同的血清型，由于历史原因，不同血清型的PALV往往以病毒首次分离地的地名进行命名，在亚洲存在ChuzanVirus(CHUV)、D’AguilarVirus(DAV)和BunyipCreekvirus(BCV)三种血清型PALV的流行。CHUV于2012年首次分离于我国云南省的哨兵牛，在随后开展的云南省、广东省和广西壮族自治区PALV监测与病毒分离工作中，除分离获得多株CHUV外，还在我国首次分离获得BCV和DAV，表明多种血清型的PALV流行于我国南方地区。我国内蒙古、新疆、山东、江苏、湖北、广西和云南等省区牛羊体内CHUV抗体的血清阳性率介于6％～48.65％之间，而海南省牛羊的血清阳性率高达57.35％；另外，甘肃省牦牛CHUV抗体的血清阳性率为7.89％。由此可见，PALV已在我国呈现广泛分布的趋势。为了掌握PALV在我国的流行及分布情况，并制定科学的防控策略，非常有必要建立PALV的快速检测方法。已有Imadeldin等和杨振兴等分别开发了巢式RT-PCR和竞争性ELISA(competitiveELISA,C-ELISA)方法用于PALV的检测，但是上述两种检测方法都存在不足之处。(1)巢式RT-PCR的不足之处：需要以第一次扩增产物作为第二次扩增的模板，容易引入污染进而导致假阳性；需要利用琼脂糖凝胶电泳进行检测，耗时较长。(2)C-ELISA的不足之处：主要对动物血液内的抗体进行检测，而从动物感染PALV到抗体产生，一般需要2～3周，因此，C-ELISA方法在抗体产生之前不能进行早期临床诊断。综上，目前尚无兼具特异性、灵敏度和快速便捷等优点于一身的检测方法，特别是缺乏对临床样本进行早期诊断的手段。因此，建立高效、快速的PALV病原学检测方法和检测试剂盒，不仅能弥补现有技术的不足，而且能够为我国PALV的诊断和防控提供技术支持和知识储备。荧光定量PCR技术是美国ABI公司于1996年推出的一种新型核酸定性及定量技术，该技术自专利技术以来，已经被广泛应用于细菌、病毒等病原体检测，具有特性强、灵敏度高、检测速度快和可进行高通量检测等优势，更为重要的是该技术可以用于临床样本检测，但是目前尚没有针对PALV的一步法实时荧光定量RT-PCR(onestepquantitativerealtimeRT-PCR,qRT-PCR)检测方法面世。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术的不足，提供一对用于PALV核酸检测的qRT-PCR引物和一条特异性TaqMan荧光探针及含有该引物和探针的检测试剂盒，以实现对中国流行PALV的定性和定量检测，从而弥补现有技术的不足。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：帕利亚姆血清群病毒的qRT-PCR检测引物，包括上游引物PALV_F和下游引物PALV_R；上游引物PALV_F：catcaatggcaacaatcggtg；(SEQIDNO.1)下游引物PALV_R：attcagcatacctgtaattcgtac。(SEQIDNO.2)本专利技术还提供与上述引物配合使用的TaqMan探针，所述的探针核苷酸序列为：FAM-ttccatatacaacgtcggcaatgacaag-BHQ1(SEQIDNO.3)。本专利技术同时提供含有上述引物和/或上述TaqMan探针的检测试剂盒。进一步，优选的是，还包括：阴性对照模板、阳性对照模板、标准品模板和PCR扩增试剂；所述的阴性对照模板为RNase-free水；所述的阳性对照模板为PALV灭活病毒；所述的标准品模板为PALV基因节段7(Seg-7)单链RNA(singlestrandRNA,ssRNA)。进一步，优选的是，PALV灭活病毒的拷贝数为2.6×107拷贝/mL；PALVSeg-7ssRNA的拷贝数为2.37×1014拷贝/mL。进一步，优选的是，所述的PCR扩增试剂包括OneStepPrimeScriptRT-PCR试剂(共3种)和ROX参比染料(ROXReferenceDyeⅡ(50×))。进一步，优选的是，所述的试剂盒的扩增体系为：2×OneStepRT-PCRBufferⅢ，10.0μL；TaKaRaExTaqHS(5U/μL)，0.4μL；PrimeScriptRTEnzymeMixⅡ，0.4μL；ROXReferenceDyeⅡ(50×)，0.4μL；上游引物PALV_F(10μmol/L)，1.6μL；下游引物PALV_R(10μmol/L)，1.6μL；探针(10μmol/L)，1.2μL；模板，1.0μL；RNase-free水，3.4μL；总计20.0μL。进一步，优选的是，所述的试剂盒的扩增程序：反转录42℃，5min，共1个循环；预变性95℃，10s，共1个循环；变性95℃，5s，退火60℃，34s，共40个循环。本专利技术提供用于对PALV进行定性和定量检测TaqMan探针的5’端以报告荧光基团标记，3’端以淬灭荧光基团标记，为防止PCR扩增时被延伸，所述探针3’端需要经过磷酸化处理。其中FAM为6-羧基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.帕利亚姆血清群病毒的实时荧光定量RT-PCR检测引物，其特征在于，包括上游引物PALV_F和下游引物PALV_R；/n上游引物PALV_F：catcaatggcaacaatcggtg；/n下游引物PALV_R：attcagcatacctgtaattcgtac。/n

【技术特征摘要】
1.帕利亚姆血清群病毒的实时荧光定量RT-PCR检测引物，其特征在于，包括上游引物PALV_F和下游引物PALV_R；
上游引物PALV_F：catcaatggcaacaatcggtg；
下游引物PALV_R：attcagcatacctgtaattcgtac。


2.与权利要求1所述引物配合使用的探针，其特征在于，所述的探针核苷酸序列为：FAM-ttccatatacaacgtcggcaatgacaag-BHQ1。


3.含有权利要求1所述引物和/或权利要求2所述探针的试剂盒。


4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括：阴性对照模板、阳性对照模板、标准品模板和PCR扩增试剂；
所述的阴性对照模板为RNase-free水；
所述的阳性对照模板为PALV灭活病毒；
所述的标准品模板为PALV基因节段7单链RNA。


5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，PALV灭活病毒的拷贝数为2.6×107拷贝/mL；PALVSeg-7ssRNA的拷贝数为2.37×1014拷贝...

【专利技术属性】
技术研发人员：李卓然，李占鸿，廖德芳，杨振兴，杨恒，肖雷，李华春，
申请(专利权)人：云南省畜牧兽医科学院，
类型：发明
国别省市：云南;53