一种区别CHUV、BCV与DAV的一步法三重RT-PCR检测引物及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种区别CHUV、BCV与DAV的一步法三重RT‑PCR检测引物及试剂盒，属于兽医传染病检测技术领域。该试剂盒包括3对引物，分别为CHUV‑P1和CHUV‑P2、BCV‑P1和BCV‑P2、DAV‑P1和DAV‑P2；还包括空白对照模板、阳性对照模板和PCR扩增试剂；空白对照模板为RNase Free Water；所述的阳性对照模板有三个，分别为CHUV、BCV、DAV灭活病毒。采用本发明专利技术试剂盒，通过一次RT‑PCR反应就能同时检测CHUV、BCV和DAV等3种PALV血清型病毒，避免了常规PCR的重复检测，具有低成本、高效率等优点，易于推广应用。

A one-step triple RT-PCR detection primer and kit for distinguishing Chuv, BCV and Dav

【技术实现步骤摘要】
一种区别CHUV、BCV与DAV的一步法三重RT-PCR检测引物及试剂盒
本专利技术属于兽医传染病检测
，具体涉及一种区别3种PALV血清型病毒CHUV、BCV与DAV的一步法三重RT-PCR检测引物及试剂盒。
技术介绍
帕利亚姆血清群病毒(Palyamserogroupvirus,PALV)属呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)成员，主要通过吸血昆虫库蠓(Culicoidesspp.)对牛羊等反刍动物的叮咬传播。其中，牛对该病最为易感，感染妊娠母牛出现流产、早产和死产，引起新生犊牛的积水性无脑小脑发育不全综合症(Hydranencephalycerebellarhypoplasiasyndrome,HCH)，给牛羊养殖业带来严重的经济损失。PALV基因组由10个节段的双链RNA组成(Seg-1～Seg-10)，编码7种结构蛋白(VP1～VP7)和4种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3与NS3a)。其中，Seg-2编码的VP2蛋白构成病毒粒子的最外层衣壳，VP2蛋白介导病毒对细胞表面受体的特异性吸附，参与病毒粒子从感染细胞中的释放，诱导PALV特异性中和抗体的产生，决定病毒的血清型；Seg-2/VP2序列在不同血清型PALV毒株之间高度变异，是鉴别PALV血清型的重要靶基因。PALV有多种不同的血清型，根据血清中和实验，目前分离出的PALV可分为6种血清群：ChuzanVirus(CHUV)、D’AguilarVirus(DAV)、BunyipCreekvirus(BCV)、CSIROVillagevirus、MarrakaiVirus与Petevovirus。我国存在CHUV、BCV与DAV三种PALV血清毒株的流行，分布范围遍及由南(海南)至北(内蒙)，由东(江苏)至西(新疆)的广泛区域，给我国牛羊养殖业的健康发展构成了严重的潜在威胁。不同血清型毒株之间缺乏有效的交叉保护作用，因此，建立PALV不同血清型的鉴定方法对预防和控制PALV具有重要的现实意义。目前有关PALV血清型鉴定技术，仅有传统的血清中和实验(Serumneutralizationtest，SNT)，虽然SNT为病毒血清型鉴定的金标准，但是在实际使用中存在一定的不足：(1)SNT耗时长，通常需要1周左右的时间，不利于疫病的快速诊断；(2)SNT需要使用活病毒，存在病毒扩散的生物安全隐患；(3)制备SNT使用的标准阳性血清，需要使用标准毒多次免疫易感动物制备，费时费力；(4)对于多种血清型毒株混合感染的样品，通过SNT进行血清型鉴定时，不同血清型毒株之间可能存在交叉反应，同时还可能漏检某些血清型；(5)SNT需要准备96孔细胞培养板、细胞培养基、胎牛血清等基础材料，增加了实验成本。病毒核酸检测是鉴定病毒血清型的常用方法。尤其是多重PCR技术，通过在同一反应管内同时加入针对不同血清型毒株的特异性引物，即可实现对多种血清型毒株混合感染样品的准确检测，具有省时省力、简单快速、敏感、特异的优点。然而目前国内尚未建立CHUV、BCV与DAV的多重PCR检测方法，严重阻碍了我国PALV流行病学与病原学的研究；因此，根据我国流行的CHUV、BCV与DAV毒株的序列信息，亟需建立相应的血清型多重PCR检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了完善现有PALV血清型鉴定技术，提供一种区别CHUV、BCV与DAV血清型的一步法三重RT-PCR检测引物及试剂盒，采用该试剂盒进行检测，简单、快速，特异性好，灵敏度高，可以用于混合感染样品中PALV病毒的快速血清型鉴定。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种区别CHUV、BCV与DAV的一步法三重RT-PCR检测引物，其特征在于，包括3对引物，分别为CHUV-P1和CHUV-P2、BCV-P1和BCV-P2、DAV-P1和DAV-P2；CHUV-P1：gaggctgtatgtggagtggagat(SEQIDNO.1)，CHUV-P2：tctatcaatggtcccacgcatct(SEQIDNO.2)，扩增产物大小为576bp；BCV-P1：gtgacgcaatctcaatggctctg(SEQIDNO.3)，BCV-P2：caacacatccgtccgccaattc(SEQIDNO.4)，扩增产物大小为705bp；DAV-P1：gcgagattgggatggatgtca(SEQIDNO.5)，DAV-P2：cagaytctccctttctcagat(SEQIDNO.6)，扩增产物大小为881bp。本专利技术同时提供含有上述区别CHUV、BCV与DAV的一步法三重RT-PCR检测引物的试剂盒。进一步，优选的是，所述的试剂盒还包括空白对照模板、阳性对照模板和PCR扩增试剂；所述的空白对照模板为RNaseFreeWater；所述的阳性对照模板为3种单一的灭活病毒CHUV、BCV与DAV。进一步，优选的是，CHUV、BCV与DAV病毒灭活前的滴度分别为4.5×103PFU/mL、3.5×103PFU/mL、6.2×103PFU/mL，病毒使用β-丙内酯灭活。进一步，优选的是，所述的PCR扩增试剂包括PrimeScript1StepEnzymeMix和2×1StepBuffer。进一步，优选的是，引物CHUV-P1：CHUV-P2：BCV-P1：BCV-P2：DAV-P1：DAV-P2的摩尔比为1：1：1.5：1.5：1.5：1.5。进一步，优选的是，所述的试剂盒，其扩增体系如表1；表1CHUV、BCV与DAV一步法三重RT-PCR反应体系共计：25μL。进一步，优选的是所述的试剂盒的扩增程序：50℃反转录30min；94℃灭活逆转录酶2min；94℃预变性30s、57℃退火30s、72℃延伸75s，30个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。进一步，若所述RT-PCR扩增产物的大小为576bp，则样品中含有CHUV；若所述RT-PCR扩增产物的大小为705bp，则样品中含有BCV；若所述RT-PCR扩增产物的大小为881bp，则样品中含有DAV；若所述RT-PCR扩增产物的大小为576bp和705bp，则样品中含有CHUV和BCV；若所述RT-PCR扩增产物的大小为576bp和881bp，则样品中含有CHUV和DAV；若所述RT-PCR扩增产物的大小为705bp和881bp，则样品中含有BCV和DAV；若所述RT-PCR扩增产物的大小为576bp、705bp和881bp，则样品中含有CHUV、BCV和DAV；所述576b的RT-PCR扩增产物的核苷酸序列具体为序列表中的序列7：SEQIDNO.7；所述705b的RT-PCR扩增产物的核苷酸序列具体为序列表中的序列8：SEQIDNO.8；所述881b的RT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种区别CHUV、BCV与DAV的一步法三重RT-PCR检测引物，其特征在于，包括3对引物，分别为CHUV-P1和CHUV-P2、BCV-P1和BCV-P2、DAV-P1和DAV-P2；/nCHUV-P1：gaggctgtatgtggagtggagat（SEQ ID NO.1）；/nCHUV-P2：tctatcaatggtcccacgcatct（SEQ ID NO.2）；/nBCV-P1：gtgacgcaatctcaatggctctg（SEQ ID NO.3）；/nBCV-P2：caacacatccgtccgccaattc（SEQ ID NO.4）；/nDAV-P1：gcgagattgggatggatgtca（SEQ ID NO.5）；/nDAV-P2：cagaytctccctttctcagat（SEQ ID NO.6）。/n

【技术特征摘要】
1.一种区别CHUV、BCV与DAV的一步法三重RT-PCR检测引物，其特征在于，包括3对引物，分别为CHUV-P1和CHUV-P2、BCV-P1和BCV-P2、DAV-P1和DAV-P2；
CHUV-P1：gaggctgtatgtggagtggagat（SEQIDNO.1）；
CHUV-P2：tctatcaatggtcccacgcatct（SEQIDNO.2）；
BCV-P1：gtgacgcaatctcaatggctctg（SEQIDNO.3）；
BCV-P2：caacacatccgtccgccaattc（SEQIDNO.4）；
DAV-P1：gcgagattgggatggatgtca（SEQIDNO.5）；
DAV-P2：cagaytctccctttctcagat（SEQIDNO.6）。


2.含有权利要求1所述区别CHUV、BCV与DAV的一步法三重RT-PCR检测引物的试剂盒。


3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括空白对照模板、阳性对照模板和PCR扩增试剂；
所述的空白对照模板为RNaseFreeWater；
...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖德芳，杨恒，杨振兴，李占鸿，李卓然，肖雷，李华春，
申请(专利权)人：云南省畜牧兽医科学院，
类型：发明
国别省市：云南;53