【技术实现步骤摘要】
一种基因工程菌及其构建方法及其在生产尼龙12单体12-氨基月桂酸中的应用
本专利技术涉及基因工程和菌株培养领域，特别是一种基因工程菌及其构建方法及其在生产尼龙12单体12-氨基月桂酸中的应用。
技术介绍
尼龙12具有密度小、分解温度高、耐低温性能优良、防噪音效果好等优点，应用广泛。尼龙12可由ω-氨基月桂酸或ω-十二内酰胺单体聚合得到，目前其工业生产主要是利用化学法合成ω-十二内酰胺然后进行开环聚合。以丁二烯为原料合成ω-十二内酰胺，需要经过三聚、催化加氢、氧化、酮化、肟化、贝克曼重排等多个步骤，存在流程长、工艺要求高、产物提取困难、收率低等问题。此外，由于丁二烯来自于石油的C4馏分，其供应受石油市场波动影响较大，而且在合成过程中要使用苯、发烟硫酸等毒性、腐蚀性较大的原料，同时产生大量废弃物，对环境造成巨大的压力。近年来，为了部分填补长碳链尼龙的国内生产空白，我国研究人员开发了发酵法生产十二烷二酸用于合成尼龙1212(刘民英等，2002)，但是其反应归根结底是双二酰与双二胺的聚合，除发酵过程外还需要经过三个化学合成步骤才能获得这些单体，并且其发酵原料为石油中的正十二烷，其供应同样受到石油市场的影响。考虑到石油原料的不可再生性和石油市场的复杂性，如果能够开发合成生物学方法利用可再生原料合成长碳链尼龙单体，将具有重大的意义。关于尼龙12单体的生物合成，目前公开发表的资料只有德国多特蒙德工业大学Bühler课题组和韩国建国大学Yun课题组分别于2013年2月、2016年7月和2018年4月发表的研究论文。Bühle...
【技术保护点】
1.一种基因工程菌，其特征在于，新菌种的名称为：Escherichia coli BL21(DE3)：P1-1-CGCAB，保藏编号为CCTCC NO：M2019571。/n
【技术特征摘要】
1.一种基因工程菌，其特征在于，新菌种的名称为：EscherichiacoliBL21(DE3)：P1-1-CGCAB，保藏编号为CCTCCNO：M2019571。
2.一种基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下内容：
一，构建重组质粒，
载体质粒包括：pETDuet系列，pACYCDuet系列，pRSFDuet系列，pCDFDuet系列质粒；
重组质粒包括：嵌合P450酶CYP153A-NCP基因的载体质粒；
嵌合BsADHC257L基因和Cv2025基因的载体质粒；
重组质粒A为含有嵌合P450酶CYP153A-NCP基因与葡萄糖脱氢酶GDH1基因的载体质粒；
重组质粒B为含有醇脱氢酶突变体BsADHC257L基因，ω-转氨酶Cv-2025基因与L-丙氨酸脱氢酶AlaDH2基因的载体质粒；
二，构建重组菌株，
将重组质粒导入宿主大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组菌株，保存。
3.根据权利要求2所述的一种基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下内容：
一，构建重组质粒；
从M.aquaeolei(DSM11845)的基因组中利用设计的引物PCR得CYP153A序列，从B.megaterium(KCCM11745)的基因组中利用设计的引物PCR得P450BM3氧化还原酶域NCP；利用重叠延伸PCR将CYP153A与NCP融合成CYP153A-NCP，并连入表达载体pETDuet-1中，构建得到质粒pET-T7-CYP153A-NCP；
从Chromobacteriumviolaceum(DSM30191)的基因组中利用设计的引物PCR得Cv2025的序列，将其连入载体pCD-T7-BsADHC257L，构建得重组质粒：pCD-T7-Cv2025-T7-BsADHC257L；
二，构建重组菌株，
将质粒pET-T7-CYP153A-NCP与pCD-T7-Cv2025-T7-BsADHC257L，导入大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组菌株：
BL-CCB:BL21(DE3)(pET-T7-CYP153A-NCP+pCD-T7-Cv2025-T7-BsADHC257L)，并以甘油菌或冻干菌种形式保存。
4.根据权利要求2所述的一种基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下内容：
一，构建重组质粒，
从M.aquaeolei(DSM11845)的基因组中利用设计的引物PCR得CYP153A序列，从B.megaterium(KCCM11745)的基因组中利用设计的引物PCR得P450BM3氧化还原酶域NCP；利用重叠延伸PCR将CYP153A与NCP融合成CYP153A-NCP，并连入表达载体pETDuet-1中，构建得到质粒pET-T7-CYP153A-NCP；
从Chromobacteriumviolaceum(DSM30191)的基因组中利用设计引物PCR得Cv2025的序列，将其连入载体
pCD-T7-BsADHC257L，构建得重组质粒pCD-T7-Cv2025-T7-BsADHC257L；从BacillusSubtilisinstr.168的基因组中利用设计的引物PCR得的序列AlaDH2，将其连入载体pCD-T7-Cv2025-T7-BsADHC257L，构建得重组质粒
B:pCD-T7-Cv2025-RBS-AlaDH2-T7-BsADHC257L；
二，构建重组菌株，
将质粒pET-T7-CYP153A-NCP与重组质粒B:pCD-T7-Cv2025-RBS-AlaDH2-T7-BsADHC257L，导入大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组菌株BL-CCAB:BL21(DE3)(pET-T7-CYP153A-NCP+pCD-T7-Cv2025-RBS-AlaDH2-T7-BsADHC257L)，并以甘油菌或冻干菌种形式保存。
5.一种基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下内容：
一，构建重组质粒，
载体质粒包括：pETDuet系列，pACYCDuet系列，pRSFDuet系列，pCDFDuet系列质粒；
重组质粒包括：嵌合P450酶CYP153A-NCP基因的载体质粒；
嵌合BsADHC257L基因的载体质粒；
嵌合BsADHC257L基因和Cv2025基因的载体质粒；
重组质粒A为含有嵌合P450酶CYP153A-NCP基因与葡萄糖脱氢酶GDH1基因的载体质粒；
重组质粒B为含有醇脱氢酶突变体BsADHC257L基因，ω-转氨酶Cv-2025基因与L-丙氨酸脱氢酶AlaDH2基因的载体质粒；
二，改造宿主大肠杆菌BL21(DE3)的基因背景，
改造后的宿主菌包括：改造宿主B-ΔD，改造宿主B1-1，改造宿主P1-1；
利用CRISPR/Cas9技术敲除宿主大肠杆菌BL21(DE3)的β-氧化途径关键酶FadD，获得改造宿主B-ΔD；
利用CRISPR/Cas9技术在大肠杆菌B-ΔD基因组的原FadD位置敲入了带有LacUV5启动子的AlkL基因，获得改造宿主B1-1；
利用CRISPR/Cas9技术在大肠杆菌B1-1基因组的原FadD位置敲入了带有T7启动子的yaaDE基因，获得改造宿主P1-1；
三，构建重组菌株，
将重组质粒导入改造后的宿主菌，获得重组菌株，保存。
6.根据权利要求5所述的一种基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下内容：
一，构建重组质粒，
从M.aquaeolei(DSM11845)的基因组中利用设计的引物PCR得CYP153A序列，从B.megaterium(KCCM11745)的基因组中利用设计的引物PCR得P450BM3氧化还原酶域NCP；利用重叠延伸PCR将CYP153A与NCP融合成CYP153A-NCP，并连入表达载体pETDuet-1中，构建得到质粒pET-T7-CYP153A-NCP；
从Chromobacteriumviolaceum(DSM30191)的基因组中利用设计引物PCR得Cv2025的序列，将其连入载体
pCD-T7-BsADHC257L，构建得重组质粒pCD-T7-Cv2025-T7-BsADHC257L；从BacillusSubtilisinstr.168的基因组中利用设计的引物PCR得的序列AlaDH2，将其连入载体pCD-T7-Cv2025-T7-BsADHC257L，构建得重组质粒
B:pCD-T7-Cv2025-RBS-AlaDH2-T7-BsADHC257L；
二，改造宿主大肠杆菌BL21(DE3)的基因背景，
利用CRISPR/Cas9技术敲除宿主大肠杆菌BL21(DE3)的β-氧化途径关键酶FadD，获得改造宿主B-ΔD；
三，构建重组菌株，
将质粒pET-T7-CYP153A-NCP与重组质粒B:pCD-T7-Cv2025-RBS-AlaDH2-T7-BsADHC257L，导入大肠杆菌B-ΔD，获得重组菌B-ΔD-CCAB：BL21(DE3)ΔfadD(pET-T7-CYP153A-NCP+pCD-T7-Cv2025-RBS-AlaDH2-T7-BsADHC257L)，并以甘油菌或冻干菌种形式保存。
7.根据权利要求5所述的一种基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下内容：
一，构建重组质粒，
从M.aquaeolei(DSM11845)的基因组中利用设计的引物PCR得CYP153A序列，从B.megaterium(KCCM11745)的基因组中利用设计的引物PCR得P450BM3氧化还原酶域NCP；利用重叠延伸PCR将CYP153A与NCP融合成CYP153A-NCP，并连入表达载体pETDuet-1...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶丽丹，于洪巍，葛佳炜，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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