一株淡紫拟青霉菌株及其应用和从中提取毒素的方法技术

本发明专利技术公开了一种对烟粉虱具有致病作用的淡紫拟青霉毒素(

A strain of Paecilomyces lilacinus and its application and the method of extracting toxin from it

【技术实现步骤摘要】
一株淡紫拟青霉菌株及其应用和从中提取毒素的方法
本专利技术涉及微生物领域，具体涉及生物防治领域，尤其涉及一种淡紫拟青霉毒素提取及鉴定的方法。
技术介绍
烟粉虱(BemisiatabaciGennadius)隶属半翅目(Hemiptera)，粉虱科(Aleyrodidae)，小粉虱属Bemisia，又名棉粉虱、一品红粉虱、甘薯粉虱等。烟粉虱为多食性害虫，生物型众多，寄主广泛，危害极大。烟粉虱可通过直接刺吸及其有效传播病毒而对作物造成损害(吴乾兴,刘勇,张友军,等.烟粉虱常用药剂抗性监测研究[J].植物保护,2018,2(1):119-120)。给许多国家的农业生产造成了巨大损失。烟粉虱所传播的病毒种类超过150种，其中由双生病毒引起的番茄黄化曲叶病是一种毁灭性病害，严重时可导致番茄100％损失，并已蔓延至其它作物。之前主要采用化学防治。由于化学杀虫剂的滥用，烟粉虱已对多种杀虫剂产生了抗性。农药的滥用不仅会导致土壤酸化、影响土壤微生物、不利作物的生长，人的健康也会因食用农药残留作物而受到影响。有机磷农药是我国生产量最大、应用最多的农药，也是我国主要环境污染源之一，研究微生物来解决农药污染的问题是未来趋势。虫生真菌的资源丰富，已经记载种类有800多种(杨运华,杜开书,石明旺.虫生真菌的生物防治研究进展[J].河南科技学院学报(自然科学版),2011,39(01):34-37)，主要分属于子囊菌及结合菌门，其中子囊菌类的球孢白僵菌(Beauveriabassiana)、绿僵菌(Metarhizium)等被开发成为重要的害虫生防制剂。病原真菌防治昆虫具有毒性低、无污染、可持续性强、有害生物不易产生抗性等优点，可有效避免化学农药带来的农药残留超标、害虫抗药性增加等一系列问题。杀虫真菌农药的研制可以使化学防治与生物防治充分协调的结合使用，使害虫防治工作更加合理、有效。我国自50年代后期开始研究用虫生真菌治虫，主要是应用球孢白僵菌防治大豆食心虫等害虫(万方浩,叶正楚,郭建英,等.我国生物防治研究的进展及展望[J].昆虫知识,2000,(02):65-74)。因此，开发研究高效、质量稳定的杀虫真菌农药已成为害虫防治的关键问题。淡紫拟青霉菌(Purpureocilliumlilacinum)，隶属丝孢纲(Hyphomycetes)、丝孢科(Hyphomycetales)、丛梗孢科(Monilaceae)、拟青霉属(Purpureocillium)。从建属以来，有近50多种淡紫拟青霉菌被报道，且多为虫生真菌(赵培静,任文彬,缪承杜,等.淡紫拟青霉研究进展与展望[J].安徽农业科学,2007,35(30):9672-9674)，淡紫拟青霉菌(Purpureocilliumlilacinum)最早分离于秘鲁根结线虫卵囊(梁照文.淡紫拟青霉的发酵条件研究及其与线虫互作机理研究方法的初探[D].南京农业大学,2007)，分布于世界各地，且寄主广泛、培养简单，防治植物病原线虫效果显著，可侵染半翅目、鳞翅目害虫，在防治植物病原菌方面也有良好效果，还能产生类生长素促进植物生长，对难溶磷酸盐类农药有降解作用。随着传统化学农药的长期使用，害虫和病原菌的抗药性日益增强、农药残留、环境污染等问题亟待解决。使用以天然产物作为先导化合物来开发新型农药是未来的一种趋势，因此深入研究淡紫拟青霉菌及其代谢产物得到了国内外研究学者广泛关注。淡紫拟青霉菌次级代谢产物存在活性物质，能抑制线虫卵及二龄幼虫发育和生长，有研究显示乙酸就是此活性物质，在浓度为0.0044mol/L距能达到抑制线虫的效果，李小龙分离得到麦角甾醇、D-甘露糖醇、麦角甾醇-7,22(E)、酵母甾醇、白僵菌素(李小龙.淡紫拟青霉518的抗菌活性及其次生代谢产物研究[D].南京农业大学,2012)。1972年，Tadashi从淡紫拟青霉的代谢产物中首次分离出一种新的抗生素leucinostatins(TadashIA,YuzuruM,KazutakaF,TakehikoU,etal.Anewantibiotic,leucinostatin,derivedfromPenicilliumlilacinum[J].JournalofAntibiotics,1973,26(3):157-61)，它是一种非核糖体肽类化合物，对多种革兰氏阳性菌和真菌有毒杀活性，对肿瘤细胞也有抑制(王刚.生防菌淡紫拟青霉的基因组及其抗生素leucinostatins生物合成途径的研究[D].中国农业科学院,2016)，也有研究表明此抗生素是杀线虫活性的指标(ParkJO,HargreavesJR,McconvilleEJetal.ProductionOfleucinostatinsandnematicidalactivityofAustralianisolatesofPaecilomyceslilacinus(Thom)Samson[J].LettersinAppliedMicrobiology,2004,38(4):271-276)。崔香(崔香,李长伟,吴长景,等.深海来源淡紫拟青霉ZBY-1的代谢产物及其抗肿瘤活性[J].国际药学研究杂志,2013,40(2):177-86)通过对来源深海的淡紫拟青霉ZBY-1代谢产物的研究中，分离出了7个化合物，它们分别为9(11)-去氢过氧化麦角甾醇、过氧化麦角甾醇、5α，6α-环氧-3β-羟基麦角甾-22-烯-7-酮、脑苷脂A、脑苷脂B、脑苷脂C、脑苷脂D。并对这7个化合物进行了体外抗肿瘤活性的初步测定，发现有两种化合物对4种癌细胞有较强的抑制作用。在实际中，仍然有必要筛选到对烟粉虱具有高致病作用的淡紫拟青霉菌，并研究其毒素具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术从西藏亚拉山雪地土壤中分离到一株对烟粉虱具有高致病作用的淡紫拟青霉菌菌株，具体是淡紫拟青霉毒素(Purpureocilliumlilacinum)菌株SCAUPL-1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号为GDMCCNO:60732。用菌株SCAUPL-1孢子悬浮液(1.0×107孢子/mL)对烟粉虱二龄若虫进行处理后第7天校正死亡率分别为达68.88％，对二龄烟粉虱具有较明显的致病力。因此，本专利技术第一方面是提供一株淡紫拟青霉毒素(Purpureocilliumlilacinum)菌株SCAUPL-1。进而提供其在防治烟粉虱中的应用。为了进一步开发菌株的潜力，本专利技术人对其产生的毒素的提取进行研究，构成本专利技术第二个方面。通过对不同萃取剂提取方法的研究，获得了更好的毒素提取方法，因而完成本专利技术的第二个方面。本专利技术还提供一种从上述的菌株中提取淡紫拟青霉毒素的方法，其包括如下步骤：(1)在所述菌株的发酵液加0.8-1.2倍体积的有机溶剂乙酸乙酯；(2)超声波震荡以打破细胞壁加速毒素萃取，优选超声振荡30-50min，最优选为40min；(3)震荡后放入0-6℃冰箱静置，用分液漏斗把萃取液进行分液，保留萃取后的有机相；进一步地，其是放入4冰箱中静置，时长2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对烟粉虱具有致病作用的淡紫拟青霉 (

【技术特征摘要】
1.一种对烟粉虱具有致病作用的淡紫拟青霉(Purpureocilliumlilacinum)菌株，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏号为GDMCCNO:60732。


2.如权利要求1所述的菌株在防治烟粉虱中的应用。


3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，将所述菌株培养后制成孢子液、含孢子的菌剂。


4.一种从如权利要求1所述的菌株中提取淡紫拟青霉毒素的方法，其包括如下步骤：
（1）在所述菌株的发酵液加0.8-1.2倍体积的有机溶剂乙酸乙酯;
（2）超声波震荡以打破细胞壁加速毒素萃取，优选超声振荡30-50min，最优选为40min；
（3）震荡后放入0-6℃冰箱静置，用分液漏斗把萃取液进行分液，保留萃取后的有机相；
（4）将萃取后的有机相进行蒸发得到粗毒素，优选采用旋转蒸发方式。


5....

【专利技术属性】
技术研发人员：吴建辉，肖卡特·阿里，乐扬，杨波，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44