一种分离的冬虫夏草菌及其在生产纤溶酶中的应用制造技术

本发明专利技术属于微生物领域，具体涉及一种分离的冬虫夏草菌及其在生产纤溶酶中的应用。本发明专利技术涉及到的冬虫夏草菌为冬虫夏草（

An isolated Cordyceps sinensis and its application in the production of fibrinolytic enzyme

【技术实现步骤摘要】
一种分离的冬虫夏草菌及其在生产纤溶酶中的应用
本专利技术属于微生物领域，具体涉及一种分离的冬虫夏草菌及其在生产纤溶酶中的应用。
技术介绍
冬虫夏草是一种寄生在昆虫体内的子囊真菌，主要分布在海拔3000-5000米的高原草甸，与人参、鹿茸并称中国传统名贵药材，具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化等多种药用功效，广义范围的虫草属真菌有400余种之多。冬虫夏草(Cordycepssinensis)在自然环境中主要通过侵染蝙蝠蛾幼虫，形成幼虫尸体与真菌子座的复合体，形体如蚕，长3～5cm，直径0.3～0.8cm，表面深黄色至黄棕色，有环纹20～30个，腹面有足8对，整体质脆易折断，断面平坦呈淡黄白色，气微腥，味微苦。冬虫夏草多产于高原地区，自然资源极为稀缺，但药用价值很高，目前出现的人工培养物多为其发酵菌丝体。蛹虫草(Cordycepsmilitaris)与冬虫夏草属于不同种，形态特征与冬虫夏草完全不同(图12)。蛹虫草子座单生或数个一起从寄生蛹体的头部或节部长出，颜色为橘黄或橘红色，全长2～8cm，蛹体颜色为紫色，长约1.5～2cm。蛹虫草来源广泛，且易于培养产生子实体，作为一种食用菌，多用于食品加工中，其来源、生物学活性和功效成分与冬虫夏草存在显著差异。有研究者扩增5.8SrDNA、ITS2区间序列并进行序列比对，发现蛹虫草和冬虫夏草的同源性仅为75％。随着研究的深入，在新的分类体系中，冬虫夏草菌归属到Ophiocordyceps属，拉丁名变更为Ophiocordycepssinensis。但现代学术论文中，冬虫夏草真菌部分仍多以Cordycepssinensis指代。张雯舒等从蛹虫草无性型深层培养液中分离得到纯化的纤溶酶，该酶是一种32kD的丝氨酸蛋白酶，最适作用温度及pH分别为41℃和7.40，纯化后的比活力为800.46U/mg(张雯舒,刘晓兰,郑喜群,等.蛹虫草无性型深层培养液中纤溶酶的分离纯化和酶学性质研究[J].微生物学通报,2012,39(12):1787-1795)，而Liu等以深层发酵法培养蛹虫草，分离得到由分子量分别为28kD和24.5kD的两个亚基组成的纤溶酶，最适温度及pH分别为37℃和7.20(LiuX,KopparapuNK,LiY,etal.BiochemicalcharacterizationofanovelfibrinolyticenzymefromCordycepsmilitaris[J].InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2016,94(PtB):793-801.)，而且一般情况，可见报道中的纤溶酶仅有纤溶酶活性，不能激活纤溶酶活性。目前尚无由固态发酵的冬虫夏草(Cordycepssinensis)菌丝体获得高活性纤溶酶的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一株冬虫夏草(Cordycepssinensis)HZ-01，该菌株的保藏编号为：CCTCCNO:M2019712。本专利技术的另一个目的在于提供了冬虫夏草(Cordycepssinensis)HZ-01在生产纤溶酶中的应用。本专利技术的最后一个目的在于提供了冬虫夏草(Cordycepssinensis)HZ-01生产纤溶酶的方法。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：本专利技术的冬虫夏草菌筛选自申请人实验室菌株资源库，经发酵后对发酵液中的蛋白类进行检测，发现其可产纤溶酶，且酶活很高，该菌株已于2019年9月11日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：冬虫夏草(Cordycepssinensis)HZ-01，保藏编号为：CCTCCNO:M2019712，地址：中国武汉武汉大学。冬虫夏草(Cordycepssinensis)HZ-01在PDA平板上生长形成菌丝，白色至红褐色，产孢少；可利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、糊精等碳源，豆粕、蛋白胨、酵母粉、牛肉浸膏、硫酸铵等氮源，在18-23℃、pH5-8范围内生长繁殖。可以在无维生素培养基上生长；pH4以下生长受限；30℃以上几乎不生长。冬虫夏草(Cordycepssinensis)HZ-01在生产纤溶酶中的应用，包括利用本专利技术的冬虫夏草(Cordycepssinensis)HZ-01或其发酵液制备纤溶酶。冬虫夏草(Cordycepssinensis)HZ-01生产纤溶酶的方法，包括下述步骤：干基的配制：麸皮26-63％、玉米粉27-72％和米糠2％-10％，以上均为质量百分比；在干基中加入干基质量的1％-2.5％(w/w)的可溶性淀粉制备成培养基，调整培养基的含水量为15-30％(v/w)，将冬虫夏草(Cordycepssinensis)HZ-01种子液按照0.1-0.24mL/g干基接入培养基中，18-23℃培养6-10d。与现有技术相比，本专利技术具有以下效果：本专利技术首次发现冬虫夏草(Cordycepssinensis)可发酵生产纤溶酶，采用固态发酵法获得冬虫夏草菌丝体，分离到胞内的高活性纤溶酶。将固态发酵的粗酶液提纯后，获得纯化的纤溶酶CSP-1，Native-PAGE凝胶电泳可见单一条带，比活力为4186.25UI/mg。经SDS-PAGE凝胶电泳检验发现，CSP-1由两个亚基组成，分子量分别为27.60KDa和23.83KDa，该酶不仅能降解纤维蛋白，而且还具有激活纤溶酶原的能力，显示出优良的新型血栓药物开发潜力。附图说明图1为HiTrapSP阳离子交换柱洗脱曲线示意图。图2为CSP-1Superdex75凝胶柱洗脱曲线示意图。图3为Native-PAGE检测样品纯度示意图。图4为SDS-PAGE检测目的酶分子量大小示意图。图5为CSP-1的最适作用温度示意图。图6为CSP-1的热稳定性示意图。图7为CSP-1最适作用pH示意图。图8为金属离子对CSP-1酶活力的影响示意图。图9为蛋白酶抑制剂对CSP-1酶活力的影响示意图。图10为CSP-1的激酶活性和纤溶酶活性示意图。图11为CSP-1对牛血纤维蛋白原水解活性示意图。图12为冬虫夏草与蛹虫草子实体的示意图；其中：a.野生冬虫夏草子实体，b.蛹虫草子实体。具体实施方式本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。纤溶酶活力的测定采用Astrup建立的纤维蛋白平板法，缓冲液使用pH7.40的PBS溶液，平板制作完成后先在37℃环境中孵育30min，再在80℃环境中保温30min，使内源性纤溶酶原灭活，以达到真实反映溶解纤维蛋白能力的目的。待测液体在37℃条件下反应18h，测量透明圈直径，计算酶活力。蛋白质浓度测定采用Bradford法测定样品中总蛋白质浓度，以牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白，检测595nm处吸光值。实施例1：冬虫夏草(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的冬虫夏草菌，所述的冬虫夏草菌为冬虫夏草（

【技术特征摘要】
1.一种分离的冬虫夏草菌，所述的冬虫夏草菌为冬虫夏草（Cordycepssinensis）HZ-01，保藏编号为：CCTCCNO:M2019712。


2.权利要求1所述的冬虫夏草（Cordycepssinensis）HZ-01在生产纤溶酶中的应用。


3.一种固态发酵冬虫夏草菌丝体获得高活性纤溶酶的方法，包括下述步骤：

【专利技术属性】
技术研发人员：梅余霞，梁运祥，臧琬婷，陈振民，胡咏梅，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42