本发明专利技术涉及一株高产微生物多糖的华泽兰内生真菌及其应用。分类命名为贵州小帽壳孢ZJSRU‑M1(Pilidiella guizhouensis ZJSRU‑M1)，该菌株已于2018年12月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018894，保藏地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学。本发明专利技术中的华泽兰内生真菌贵州小帽壳孢ZJSRU‑M1，能液体发酵生产多糖，因此可采用本发明专利技术的贵州小帽壳孢ZJSRU‑M1生产多糖，为多糖的生产提供新的方法。本发明专利技术制备的贵州小帽壳孢多糖分子量大，色素少，多糖含量大于80％。且本发明专利技术的多糖制备方法简便、快速、高效、成本低，适用于多糖的大规模生产。并且本发明专利技术制备的多糖具有较好的抗氧化活性，对DPPH清除率、超氧阴离子清除率和·OH清除率的效果均比较好，可开发为天然的抗氧化剂。
An endophytic fungus of Eupatorium adenophorum and its application
【技术实现步骤摘要】
一株高产多糖华泽兰内生真菌及其应用
本专利技术属微生物属微生物学领域，具体涉及一株高产微生物多糖的华泽兰内生真菌及其应用。
技术介绍
多糖是存在于自然界的醛糖、酮糖的聚合物，为一切有机体生命不可缺少的重要组成部分。多糖类化合物具有提高人体免疫功能、抗肿瘤、抗辐射以及抗氧化等诸多生物活性，已受到广泛关注。自然界还有非常丰富的多糖资源亟待研究和开发。微生物多糖具有生产条件可控、种类繁多、产量高等特点，其发展前景广阔，具有较强的市场竞争力。微生物来源的多糖已作为胶凝剂、成膜剂、保鲜剂、乳化剂等广泛应用于食品、制药、石油、化工等多个领域。近几年，随着对微生物多糖研究的深入，世界上微生物多糖的产量和年增长量迅速，已规模生产的微生物胞外多糖有黄原胶(Xanthangum)、结冷胶(Gellangum)、小核菌葡聚糖(Scleeroglucan)、短梗霉多糖(Pullulan)、热凝多糖(Curdlan)等。从药用植物内生真菌中寻找活性成分已成为研究的热点。从植物内生菌中获得丰富多样和具有生物学活性的代谢产物，突破药用植物生长周期长、产量低、不可再生等限制。华泽兰(EupatoriumchinenseL.)为菊科泽兰属植物，为一年生或多年生草本植物，在我国，主要分布于东南部至西南部各省。传统药理研究表明，华泽兰具有清热解毒、凉血利咽、抗炎镇痛等功效。目前，对华泽兰内生真菌的研究报道较少，没有华泽兰内生真菌以及小帽壳孢属Pilidiellasp产多糖的研究报道。且目前真菌多糖的提取主要通过水提醇沉、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法，不仅步骤繁琐、操作过程复杂，而且多糖的得率低，不利于大规模生产应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种华泽兰内生真菌菌株，该菌株属于贵州小帽壳孢ZJSRU-M1(PilidiellaguizhouensisZJSRU-M1)，是采用内生菌分离纯化技术从华泽兰(EupatoriumchinenseL.)健康植物活体中分离、纯化得到。本专利技术的目的还在于提供一种华泽兰内生真菌菌株所产生的胞外多糖，该胞外多糖具有抗氧化作用。本专利技术的目的还在于提供了华泽兰内生真菌ZJSRU-M1液体发酵生产多糖的方法。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案为：一种华泽兰内生真菌菌株，分类命名为贵州小帽壳孢ZJSRU-M1(PilidiellaguizhouensisZJSRU-M1)，该菌株已于2018年12月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2018894，保藏地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)，邮编：430072。本专利技术所述的华泽兰内生真菌ZJSRU-M1，它为贵州小帽壳孢Pilidiellaguizhouensis，隶属于子囊菌门Ascomycota、粪壳菌纲Sordariomycetes、间座壳目Diaporthales、裂圆盾菌科Schizoparmaceae。专利技术所述的华泽兰内生真菌ZJSRU-M1，它为贵州小帽壳孢Pilidiellaguizhouensis，在马铃薯固体培养基上28℃培养，ZJSRU-M1菌落生长较快，培养3-4d，菌落直径为8.0-9cm，花瓣轮纹状，菌丝白色、稀疏。7d后菌落逐渐变为棕色，产生黑色孢子器。显微镜下观察，菌丝发达，分生孢子光滑，透明，梭形至长椭圆形。本专利技术通过提取所述的华泽兰内生真菌ZJSRU-M1的总DNA，以通用引物ITS1和ITS4为引物，成功扩增了它的ITS区序列，所扩增的序列大小约为550bp。将它们交由上海生工生物工程有限公司测序。将ITS序列提交Genebank，本专利技术菌株ZJSRU-M1序列与Pilidiellaguizhouensis序列同源性为99％。结合形态学观察与系统进化树分析，该菌鉴定为Pilidiellaguizhouensis。本
技术实现思路
还包括上述的华泽兰内生真菌ZJSRU-M1在液体发酵生产多糖方面的应用。其中，上述液体发酵培养基具体配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL。本
技术实现思路
还包括一种采用华泽兰内生真菌ZJSRU-M1液体发酵生产多糖的方法，将上述的华泽兰内生真菌ZJSRU-M1接种到固体培养基上活化，然后接种到液体发酵培养基上培养7-14天。其中，上述固体培养基为马铃薯固体培养基，上述液体培养基具体配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL。发酵条件为：温度20-30℃，转速100-180r/min。其中，上述最佳的发酵条件为：28℃，150r/min条件下震荡培养7天。其中，通过sevag法对发酵液脱蛋白，然后在发酵液中加入95％乙醇使含醇量达到20％以沉淀发酵产物，发酵产物经无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤后冷冻干燥，经红外光谱分析比对确定发酵产物为多糖。有益效果：与现有技术相比，本专利技术的优点是：本专利技术中的华泽兰内生真菌贵州小帽壳孢ZJSRU-M1，能液体发酵生产多糖，因此可采用本专利技术的贵州小帽壳孢ZJSRU-M1生产多糖，为多糖的生产提供新的方法。本专利技术制备的贵州小帽壳孢多糖分子量大，色素少，多糖含量大于80％。且本专利技术的多糖制备方法简便、快速、高效、成本低，适用于多糖的大规模生产。并且本专利技术制备的多糖具有较好的抗氧化活性，对DPPH清除率、超氧阴离子清除率和·OH清除率的效果均比较好，可开发为天然的抗氧化剂。附图说明图1为华泽兰内生真菌贵州小帽壳孢ZJSRU-M1发酵产物的红外光谱图图2为华泽兰内生真菌贵州小帽壳孢ZJSRU-M1的菌落形态图和显微形态图(a-b：菌落形态(a：正面，b：反面)；c：菌丝；d：分生孢子)图3为总DNA经通用引物ITS1/ITS4PCR扩增后凝胶电泳图(M：Marker；泳道L1：目的条带)；图4为内生真菌ZJSRU-M1菌株基于ITS序列的系统发育树(采用邻接法构建)图5(A)、5(B)、5(C)为内生真菌ZJSRU-M1胞外多糖的抗氧化试验结果。(A：DPPH清除率；B：超氧阴离子清除率；C：·OH清除率)具体实施方式实施例1：华泽兰内生真菌贵州小帽壳孢ZJSRU-M1的分离本实施例中华泽兰内生真菌贵州小帽壳孢ZJSRU-M1，分离自健康的华泽兰叶片。实验材料于2017年10月采自杭州西山国家森林公园。分离按如下步骤进行：取健康的野生华泽兰叶片，用蒸馏水冲洗干净。用75％酒精表面消毒1min，无菌水清洗3次，转入到3％的次氯酸钠溶液中表面消毒2min，用无菌水冲洗4次。在无菌条件下将桑叶撕成小片，接入PDA平板上，于25℃培养箱中培养3-7d。将最后一次清洗样品所用无菌水涂布于PDA平板上作为对照，同样条件下培养、观察，以确保表面消毒彻底。每日定时观察内生真菌长出情况，将切口处新长出的菌丝挑取尖端部分转接至培养基上，纯化培养直至获得纯菌株。马铃薯(PDA)固体培养基：称取200g去皮马铃薯本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.华泽兰内生真菌，其特征在于，其分类命名为贵州小帽壳孢ZJSRU-M1(Pilidiellaguizhouensis ZJSRU-M1)，该菌株已于2018年12月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2018894。/n
【技术特征摘要】
1.华泽兰内生真菌，其特征在于，其分类命名为贵州小帽壳孢ZJSRU-M1(PilidiellaguizhouensisZJSRU-M1)，该菌株已于2018年12月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2018894。
2.权利要求1所述的华泽兰内生真菌在生产胞外多糖方面的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述华泽兰内生真菌通过液体发酵生产制备多...
【专利技术属性】
技术研发人员：张建芬，陈虹，柯薇，陈蔚青，
申请(专利权)人：浙江树人学院浙江树人大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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