一种改良的真菌原生质体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种改良的真菌原生质体的制备方法。真菌菌丝经洗涤、酶解破壁、收集原生质体，然后进行再生培养，最后挑取目标单菌落，并进行是否单核体检验，获得原生质体单核菌株；所述的真菌菌丝的制备方法为：在真菌固体培养基上覆盖一层灭菌的膜得到带膜培养基，在带膜培养基上接种真菌，然后培养直至长出菌丝，取膜上菌丝，即获得真菌菌丝。本发明专利技术的改良的真菌原生质体制备方法，其污染率低、原生质体的数量、再生率和单核率高，为真菌组学研究和杂交育种提供稳定高效的基础技术支撑。

An improved method for the preparation of fungal protoplasts

【技术实现步骤摘要】
一种改良的真菌原生质体的制备方法
：本专利技术属于真菌原生质体制备领域，具体涉及一种改良的真菌原生质体的制备方法。
技术介绍
：原生质体制备是真菌研究人员常用的技术方法，它可用于获得单核体，为真菌组学研究和杂交育种等提供高质量的试验材料，因此是极重要的基础技术。目前文献报道的真菌原生质体单核菌株制备方法，最常见的是先对菌株进行液体发酵；接着收集液体菌丝进行反复洗涤、酶解破壁(早期也有使用物理破壁)、收集原生质体；然后进行再生培养；最后挑取目标单菌落，并进行是否单核体检验。原生质体制备单核体的效果主要取决于四点：一是有无污染；二是原生质体数量；三是原生质体再生率；四是单核率。但是笔者研究发现，现有技术中的真菌原生质体的制备方法中仅“污染率”就严重制约了原生质体单核菌株制备的成功率，即使没污染，原生质体的数量、再生率和单核率都比较低。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种污染率低(甚至无污染)、原生质体的数量、再生率和单核率高的改良的真菌原生质体的制备方法。本专利技术的改良的真菌原生质体的制备方法，包括以下步骤：真菌菌丝经洗涤、酶解破壁、收集原生质体，然后进行再生培养，最后挑取目标单菌落，并进行是否单核体检验，获得原生质体单核菌株；所述的真菌菌丝的制备方法为：在真菌固体培养基上覆盖一层灭菌的膜得到带膜培养基，在带膜培养基上接种真菌，然后培养直至长出菌丝，取膜上菌丝，即获得真菌菌丝。优选，所述的膜是赛璐玢膜。优选，所述的真菌是灵芝(Ganodermalingzhi)。优选，所述的真菌菌丝的制备方法为：在真菌固体培养基上覆盖一层灭菌的赛璐玢膜得到带膜培养基，在带膜培养基上接种灵芝(Ganodermalingzhi)的种块，盖好平板，并用封口膜封住，25℃暗培养5-10天，真菌长出菌丝，在超净台内用无菌镊子挑起赛璐玢膜，取菌丝体置于离心管中，获取菌丝，所述的真菌固体培养基是加富综合PDA培养基，每升配制方法为：先马铃薯洗净去皮，再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂，过滤取滤汁，再与琼脂20g，葡萄糖20g，KH2PO43g，MgSO41.5g，蛋白胨10g，维生素B10.2-0.5g混合，加水至总体积为1000ml，混合均匀，灭菌即得。所述的经洗涤、酶解破壁、收集原生质体，然后进行再生培养，最后挑取目标单菌落，并进行是否单核体检验，获得原生质体单核菌株，具体步骤为：A、称取记录真菌菌丝重量，用稳渗液洗涤，离心弃上清取菌丝；B、按照“每300mg菌丝加1ml酶液”的量加入质量分数为2％的溶壁酶，30℃水浴酶解2.5小时；C、用G3砂芯漏斗超真空抽滤滤去菌丝，抽滤瓶收集原生质体，用稳渗液再次洗涤抽滤菌丝后，将原生质体从抽滤瓶转移至离心管，稳渗液洗涤离心弃上层，用稳渗液重悬获得原生质体悬液；D、将原生质体悬液接种至液体再生培养基中培养生长，生长后取长好的原生质体培养液涂布到固体再生培养基上生长，挑取单菌落，再接种到固体再生培养基，待单菌落菌丝长满平板，对其进行是否单核体检验，获得目标单核菌株。所述的稳渗液为0.6mol/L甘露醇溶液，所述的每升液体再生培养基的配制方法为：将麦芽糖10g，葡萄糖4g，酵母粉4g溶于稳渗液中，加稳渗液至总体积为1000ml，灭菌冷却后，在无菌环境下，按每50ml液体培养基加0.25ml的10mg/ml氨苄青霉素液和0.25ml的10mg/ml盐酸四环素液，即得液体再生培养基；所述的固体再生培养基每升配制方法如下：将纤维二糖15g，蛋白胨2g，酵母粉4g，溶于稳渗液中，加入15g的琼脂，用稳渗液定容至总体积为1000ml，灭菌。本专利技术的改良的真菌原生质体制备方法，其污染率低、原生质体的数量、再生率和单核率高，为真菌组学研究和杂交育种提供稳定高效的基础技术支撑。附图说明：图1是菌丝体培养及收集；图2是酶解后收集到的原生质体；图3是单核和双核菌丝的显微镜检，双核菌丝可见锁状联合(箭头所示)。具体实施方式：以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。实施例1：一、实验所需试剂耗材准备1.0.22μm无菌滤膜、离心管、一次性针筒(过滤用)、枪头、一次性培养皿、封口膜，均为无菌。2.带膜培养基：将赛璐玢膜剪成直径约8cm的圆，灭菌备用；在超净台内将灭菌后的加富综合PDA培养基倒平板(直径9cm培养皿)，待培养基平面略凝固后平铺上一层灭菌赛璐玢膜，即做成带膜培养基。加富综合PDA培养基：先马铃薯洗净去皮,再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂，过滤取滤汁，再与琼脂20g，葡萄糖20g，KH2PO43g，MgSO41.5g，蛋白胨10g，维生素B10.3g混合，加水至总体积为1000ml，混合均匀，灭菌即得。3.抗生素1)10mg/ml氨苄青霉素，溶剂为水：经0.22μm无菌滤膜过滤除菌备用2)10mg/ml盐酸四环素，溶剂为水：经0.22μm无菌滤膜过滤除菌备用4.稳渗液：配制0.6mol/L甘露醇，溶剂为水，经0.22μm无菌滤膜过滤除菌备用5.2％溶壁酶：使用上述稳渗液配制浓度为质量分数2％的溶壁酶溶液，经0.22μm无菌滤膜过滤除菌，为保证酶活性，使用前再配制。6.实验所需培养基1)MYG再生培养基：麦芽糖10g，葡萄糖4g，酵母粉4g，pH自然，溶于上述稳渗液中，总体积为1000ml，分装入100ml三角瓶(每瓶装50ml液体培养基)灭菌后，超净台内加入抗生素(每瓶加入250μl上述氨苄青霉素和250μl上述盐酸四环素)。2)纤维二糖再生培养基(固体再生培养基)：纤维二糖15g，蛋白胨2g，酵母粉4g，溶于上述稳渗液中，加入15g琼脂，定容至总体积为1000ml，灭菌后，超净台内倒平板备用。二、实验步骤1.上述带膜培养基的膜上无菌接入黄豆大小的灵芝(Ganodermalingzhi)种块，盖好平板，并用封口膜封住，25℃暗培养7天。2.在超净台内用无菌镊子轻轻挑起玻璃纸，取适量灵芝菌丝体置于离心管中，称取记录鲜菌丝体净重，用稳渗液洗涤一次，离心弃上清。以液体发酵获得的菌丝作为对照(以下称为液体发酵)，菌丝的具体获取方法如下：将灵芝(Ganodermalingzhi)种块接种到含有液体加富综合PDA培养基的三角瓶中，25℃暗培养7天，在超净台内，用灭菌的镊子或接种铲取出适量菌丝球置于离心管中，高速离后心弃上清，尽量用接种铲按压菌丝球，挤出残液，称取记录鲜菌丝体净重，用稳渗液洗涤并离心弃上清反复三次。所述的液体加富综合PDA培养基：先马铃薯洗净去皮,再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂，过滤取滤汁，再与葡萄糖20g，KH2PO43g，MgSO41.5g，蛋白胨10g，维生素B10.3g混合，加水至总体积为1000ml，混合均匀，灭菌即得。本专利技术以加富综合PDA培养基倒平板(直径本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种改良的真菌原生质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：真菌菌丝经洗涤、酶解破壁、收集原生质体，然后进行再生培养，最后挑取目标单菌落，并进行是否单核体检验，获得原生质体单核菌株；/n所述的真菌菌丝的制备方法为：在真菌固体培养基上覆盖一层灭菌的膜得到带膜培养基，在带膜培养基上接种真菌，然后培养直至长出菌丝，取膜上菌丝，即获得真菌菌丝。/n

【技术特征摘要】
1.一种改良的真菌原生质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：真菌菌丝经洗涤、酶解破壁、收集原生质体，然后进行再生培养，最后挑取目标单菌落，并进行是否单核体检验，获得原生质体单核菌株；
所述的真菌菌丝的制备方法为：在真菌固体培养基上覆盖一层灭菌的膜得到带膜培养基，在带膜培养基上接种真菌，然后培养直至长出菌丝，取膜上菌丝，即获得真菌菌丝。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的经洗涤、酶解破壁、收集原生质体，然后进行再生培养，最后挑取目标单菌落，并进行是否单核体检验，获得原生质体单核菌株，具体步骤为：
A、称取记录真菌菌丝重量，用稳渗液洗涤，离心弃上清取菌丝；
B、按照“每300mg菌丝加1ml酶液”的量加入质量分数为2％的溶壁酶，30℃水浴酶解2.5小时；
C、用G3砂芯漏斗超真空抽滤滤去菌丝，抽滤瓶收集原生质体，用稳渗液再次洗涤抽滤菌丝后，将原生质体从抽滤瓶转移至离心管，稳渗液洗涤离心弃上层，用稳渗液重悬获得原生质体悬液；
D、将原生质体悬液接种至液体再生培养基中培养生长，生长后取长好的原生质体培养液涂布到固体再生培养基上生长，挑取单菌落，再接种到固体再生培养基，待单菌落菌丝长满平板，对其进行是否单核体检验，获得目标单核菌株。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的膜是赛璐玢膜。


4.根据权利要求1或2所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄龙花，史钏，刘远超，莫伟鹏，梁晓薇，胡惠萍，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所广东省微生物分析检测中心，广东粤微食用菌技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44